癌遺伝子産物による糖蛋白質糖鎮転移酵素群の活性発現制御機構

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今年度の研究実施計画として、まず、N結合型及びO結合型糖鎖付加部位をただ一カ所持つヒトインターロイキン5(IL5)をマウス繊維芽細胞で発現させることを掲げた。JCRBより入手したヒトIL5cDNA全長を利用し、SRαプロモーター下流に連結し、安定発現形質転換細胞取得用としてブラストサイジンS耐性遺伝子(bsr)を組み込んだプラスミドを作成し、マウス繊維芽細胞NIH3T3及びV-srcで形質転換されたNIH3T3に導入した。薬剤耐性を獲得した形質転換細胞の培養上清を用いて抗ヒトIL5抗体による検出及びマウスIL5依存性細胞Y16の増殖刺激活性を検討した。市販の抗体によってはヒトIL5を検出することはできなかったが、Y16の増殖刺激活性は認められた。さらに、ヒトIL5の発現量の増強をはかるため、以下の点を考慮し新たなプラスミドの構築を行った。(1)より強力なプロモーターであるCAGプロモーターの利用、(2)効率的な翻訳に必要なKOZAK配列の導入、(3)mRNAの不安定化を引き起こす3'非翻訳領域の除去、(4)より効率的な薬剤耐性細胞の取得に利用できるブラストサイジンS耐性遺伝子(BSD)の使用。現在、以上の特徴を持つプラスミドの構築を完了するとともに、薬剤耐性細胞の取得を行っており、今後、抗ヒトIL5抗体による検出及びY16の増殖刺激活性を検討する予定である。また、もう一つの今年度の研究実施計画として培養上清中のヒトIL5の精製及び糖鎖構造の解析を掲げた。現在、抗体カラム作成に必要な量の抗ヒト(及びマウス)IL5単クローン抗体(NC17)をヌードマウスの腹水中より取得している。一方、先に記入したようにヒトIL5を効率良く分泌、生産する形質転換細胞が樹立されていないので、精製は行っていないが、樹立され次第、精製、糖鎖構造の解析を行う予定である。