癌遺伝子産物による糖蛋白質糖鎮転移酵素群の活性発現制御機構

癌基因产物调节糖蛋白糖基转移酶活性表达的机制

• 批准号: 06760301
• 负责人: 相川 順一
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06760301/
• 关键词: ヒトインターロイキン5; N結合型糖鎮; マウス繊維芽細胞; NIH3T3; V-src; ブラスイサイジンS

今年度の研究実施計画として、まず、N結合型及びO結合型糖鎖付加部位をただ一カ所持つヒトインターロイキン5(IL5)をマウス繊維芽細胞で発現させることを掲げた。JCRBより入手したヒトIL5cDNA全長を利用し、SRαプロモーター下流に連結し、安定発現形質転換細胞取得用としてブラストサイジンS耐性遺伝子(bsr)を組み込んだプラスミドを作成し、マウス繊維芽細胞NIH3T3及びV-srcで形質転換されたNIH3T3に導入した。薬剤耐性を獲得した形質転換細胞の培養上清を用いて抗ヒトIL5抗体による検出及びマウスIL5依存性細胞Y16の増殖刺激活性を検討した。市販の抗体によってはヒトIL5を検出することはできなかったが、Y16の増殖刺激活性は認められた。さらに、ヒトIL5の発現量の増強をはかるため、以下の点を考慮し新たなプラスミドの構築を行った。(1)より強力なプロモーターであるCAGプロモーターの利用、(2)効率的な翻訳に必要なKOZAK配列の導入、(3)mRNAの不安定化を引き起こす3'非翻訳領域の除去、(4)より効率的な薬剤耐性細胞の取得に利用できるブラストサイジンS耐性遺伝子(BSD)の使用。現在、以上の特徴を持つプラスミドの構築を完了するとともに、薬剤耐性細胞の取得を行っており、今後、抗ヒトIL5抗体による検出及びY16の増殖刺激活性を検討する予定である。また、もう一つの今年度の研究実施計画として培養上清中のヒトIL5の精製及び糖鎖構造の解析を掲げた。現在、抗体カラム作成に必要な量の抗ヒト(及びマウス)IL5単クローン抗体(NC17)をヌードマウスの腹水中より取得している。一方、先に記入したようにヒトIL5を効率良く分泌、生産する形質転換細胞が樹立されていないので、精製は行っていないが、樹立され次第、精製、糖鎖構造の解析を行う予定である。

This year's research plan is to explore the development of N-binding, N-binding and O-binding glycan binding sites. JCRB started to use the full length of IL5 cDNA, SRα, to obtain stable and morphologically transformed cells, and to construct and introduce resistant genes (bsr) into NIH 3T3 and NIH 3T3 cells. The culture supernatant of the cells with high tolerance and high proliferation activity was detected by anti-IL5 antibody. The growth stimulating activity of IL-5 and Y16 was detected by ELISA. In addition, the development of IL-5 has been strengthened, and the following points are considered for new construction. (1)(2) introduction of KOZAK sequences necessary for efficient gene translation;(3) induction of mRNA instability;(3) elimination of 3'non-translation domains;(4) utilization of efficient gene translation and use of S resistant gene (BSD) in the acquisition of resistant cells. Now, the above characteristics are required to complete the construction of the cell line, and the acquisition of resistant cells is required. In the future, the detection of anti-IL-5 antibodies and the evaluation of the proliferation stimulating activity of Y16 are expected. This year's research project was carried out to refine IL-5 in culture supernatant and to reveal the structure of sugar chain. Now, the necessary amount of anti-IL-5 antibody (NC-17) can be obtained in the ascitic fluid. The first step is to record IL-5 efficiently, secrete it, produce it, and change the quality of cells. The second step is to establish it, refine it, and analyze the sugar lock structure.