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ヒトミトコンドリア・DNAヌクレオイド構成成分の網羅的同定

人类线粒体DNA核苷成分的全面鉴定

基本信息

批准号：
16012250
负责人：
康東天
金额：
$ 3.2万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

(目的)ヒトmtDNAの維持におけるヌクレオイド構造の役割を明らかにするため、まずヌクレオイド構成成分の同定を目的とした。ヒトmtDNAヌクレオイドの精製には、その主要構成成分であるミトコンドリア転写因子A(TFAM)に対する抗体で免疫沈降するというアプローチを取った。特にヌクレオイドのコアな構成成分を明らかにする目的で、架橋剤を用い、mtDNAにクロスリンクされるタンパク質の同定を試みた。(成果)1)ヒトmtDNAに結合タンパク質ホルムアルデヒドによる架橋反応後、mtDNA-タンパク質複合体を抗TFAM抗体で免疫沈降し、1次元SDS-PAGEに展開後、ゲル全体を40に細切し、トリプシン消化後LC/MS/MSにてすべての切片に含まれるタンパク質を同定した。HelaおよびJurkat細胞を用いてそれぞれ2回計4回のすべての実験において、架橋剤プラス時のみに見出されるタンパク質はわずか5分類に集約できた。(1)DNA、RNAに結合することが示唆されているもの(2)Heat shock protein(3)Ribosomal protein(4)TCAサイクル関連(5)脂肪酸β酸化系このように、非常に限られたグループに分類できることはこのクロスリンク免疫沈降系の特異性の高さを示している。また、mtDNAがTCAサイクルと脂肪酸β酸化系代謝経路の効率的な進行のための足場となっている可能性と両代謝経路タンパク質のいくつかは、ヌクレオイドの維持にも働くbifunctinalなタンパク質である可能性を示唆している。2)ヌクレオイドのmtDNA維持における役割TFAM過剰発現細胞株の作製とRNAiノックダウンにより、TFAMが主要なmtDNAコピー数の制御因子であり、ヌクレオイド構造がmtDNA安定性に必須であることを明らかにした

(Objective) To maintain mtDNA and identify its constituent elements. The main components of the purified mtDNA are the protein expression factor A(TFAM) and the immune response factor. In particular, the composition of mtDNA is clearly defined, the bridging agent is used, and the mtDNA is identified. (Results)1) After bridging reaction, mtDNA binding protein complex and anti-TFAM antibody were immunoprecipitated, 1-dimensional SDS-PAGE was developed, the whole sample was cut at 40 ℃, and the quality of the protein was determined by LC/MS/MS after digestion. Hela and Jurkat cells are divided into two groups, four groups and five groups. (1)DNA, RNA binding,(2)Heat shock protein,(3)Ribosomal protein,(4)TCA protein association,(5) Fatty acid beta acidification system,(5) Very limited,(6) High specificity of immunosedimentation system. The possibility that mtDNA can be used for the production of fatty acid β-acidification in metabolic pathways is discussed. 2) TFAM is the main factor controlling mtDNA production and stability.