人工転写因子ライブラリーを用いた網羅的遺伝子同定

使用人工转录因子库进行全面基因鉴定

• 批准号: 17019036
• 负责人: 世良 貴史
• 金额: $ 3.01万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17019036/
• 关键词: 遺伝子発現; 転写因子; DNA結合タンパク質

まず、人工転写因子ライブラリー発現ベクターのプリカーサーを作成した。このベクターに人工転写因子遺伝子を導入した発現ベクターを作成し、このベクターでヒト由来細胞HEK293を形質転換し、この遺伝子が効率よく発現されることをウェスタンブロットで確認した。また、人工転写因子ライブラリー作成に必要なすべてのDNAフラグメントのデザインを完了した。まずグアニン(G)が豊富な塩基配列を認識できるように(ヒトのプロモーター配列はGが豊富な場合が多い)、ライブラリー全体の4分の1に該当するDNAフラグメント作成用のDNAオリゴマーを購入し、(部分的な)ライブラリーを作成した。このライブラリーを発現ベクターのプリカーサーに導入したもので大腸菌を形質転換し、生成してきた50個以上のコロニーからDNAベクターを単離し、各々の塩基配列を決定したところ、各DNAフラグメントがランダムにアッセンブルされて、狙い通りの(部分的だが)人工転写因子ライブラリーができることを確認した。こうして得られた人工転写因子ライブラリーをヒト由来細胞に遺伝子導入したが、1回目のセレクション操作における標的の性質を示した細胞の割合が極端に低かったので、現在、遺伝子導入時の実験条件等の最適化を行なっているところである。また、残り4分の3のDNAフラグメント作成用のDNAオリゴマーを購入し、完全なライブラリーの作成も現在行なっているところである。

首先，制备了人工转录因子文库表达载体的前体。创建了一个表达载体，其中将人工转录因子基因引入该载体，并使用该载体转化了人工转录因子基因，并且Western blot证实了该基因有效地表达了该基因。我们还完成了创建人工转录因子库所需的所有DNA片段的设计。首先，我们为与整个库的四分之一相对应的DNA片段购买了DNA低聚物，以创建DNA片段，以便可以识别鸟嘌呤（G） - 富基碱基序列（通常在人体启动子序列中G-Rich），并创建一个（部分）库。将该库引入了表达载体的前体以转化大肠杆菌，并从已产生的50多个菌落中分离出DNA载体，并确定了基本序列，并随机组装了每个DNA片段以确认作为目标（部分意图）的人工转录因子的库是由目标产生的。这样获得的人工转录因子文库被转移到人来源的细胞中，但是在第一个选择过程中显示靶特性的细胞的比例极低，目前正在针对实验条件以及基因转移期间进行优化。我们还购买了其余的DNA片段的四分之三，目前正在创建完整的库。