腋芽の休眼・成長に関わるプラスチドの機能獲得に関する研究

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茎のプラスチドに局在し、頂芽切除によって変動するタンパク質を網羅的に同定することで、茎のオルガネラを理解し、腋芽の成長制御をオルガネラの観点から解析することを目的としている。頂芽切除前後のエンドウの茎からプラスチドを調製し、両プラスチドに含まれるタンパク質で量が変動するものを、質量分析法を用いた比較プロテオーム解析により検索した。比較プロテオーム解析は、質量の異なる修飾基(^<12>Cが^<13>Cに置換してある)を用いて、比較する試料を標識し、両者の量比を比較することによって行った。今年度はICPL(Isotope Coded Protein Labeling)法とNBS(13CNBS Stable Isotope Labeling)法で比較プロテオーム解析を行った。ICPL法では、まず両試料のタンパク質群のLys残基のε-アミノ基をニコチン酸(^<12>C_6/^<13>C_6)-NHSで修飾した。次にタンパク質群の複雑度を下げるために、SDS-PAGEでタンパク質を分画し、ゲルを87片の短冊に切り出した。各ゲル片をトリプシンでin gel消化し、生じたペプチド断片を逆相クロマトグラフィーで約50の画分に分画し、MALDI-TOF MSで解析した。質量差が6マスのペアペプチドイオンを探し、両者の量を比較した。その結果、頂芽切除前と切除3時間後、6時間後で量比に変化のあるペプチドが見いだされたが、概ね2倍以内の差であった。一方、NBS法ではタンパク質中のTrp残基を質量の異なるNitrobenzenesulfenyl(NBS)基(^<12>C_6/^<13>C_6)で特異的に修飾した。標識したタンパク質群をトリプシンで消化後、標識されたペプチドを、標識によって増加したペプチドの疎水性を利用しPhenyl Sepharoseカラムで濃縮した。このことによりペプチドの複雑度を下げることができた。8画分に分画した溶出試料をMALDI-TOF MSで解析し、質量差が6マスのペアペプチドイオンを探し、両者の量を比較した。しかし、ICPL法の場合と同様に顕著な差のあるペプチドを検出することはできなかった。