フォールディング・エレメント間相互作用に基づく蛋白質構造形成機構の解明

蛋白質のフォールディング・エレメント(FE)とは、「主鎖の連結が天然構造形成に必須な部位」であり、蛋白質のfoldabilityの決定因子を解明する上での重要な手がかりになると期待されている。本研究では、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をモデル蛋白質として用い、FE巻相互作用という新たな観点から、蛋白質のフォールディング機構を解明することを目的として研究をすすめている。本年度は以下の成果を得た。1.FE間相互作用の形成過程:連続フロー蛍光TCSPC法を用いて、サブミリ秒の時間域におけるDHFRのフォールディング反応を測定した結果、ミリ秒以内にFE3,FE4,FE5周辺の相互作用が部分的に形成されることが示唆された。また、FE外領域に蛍光プローブAEDANSを導入し、TrpとAEDANS間の蛍光エネルギー移動を測定することにより、ラベル導入部位周辺のFE間相互作用を観測することを試みた結果、折り畳み反応開始後30μ秒以内に、DHFRのアデノシン結合サブドメインの構造がコンパウトになっているのに対し、ループ・サブドメインはやや広がった構造をしていることが示唆された。2.FE間相互作用の効率的な形成方法の探索:FEの連結方法、FE間リンカーにおける制約を調べることを目指して研究を行った。DHFRを3つのブロックに分け、それらの連結順序を様々に変えた変異体を作成し、蛋白質の構造形成能を調べた結果、蛋白質がfoldableになるためには、FEの連結順序に制約があること、また、FE間リンカー長が可変であることなどが明らかになった。

蛋白質のフォールディング・エレメント(FE)とは、「主鎖の連結が天然構造形成に必須な部位」であり、蛋白質のfoldabilityの決定因子を解明する上での重要な手がかりになると期待されている。本研究では、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をモデル蛋白質として用い、FE巻相互作用という新たな観点から、蛋白質のフォールディング機構を解明することを目的として研究をすすめている。本年度は以下の成果を得た。1.FE間相互作用の形成過程:連続フロー蛍光TCSPC法を用いて、サブミリ秒の時間域におけるDHFRのフォールディング反応を測定した結果、ミリ秒以内にFE3,FE4,FE5周辺の相互作用が部分的に形成されることが示唆された。また、FE外領域に蛍光プローブAEDANSを導入し、TrpとAEDANS間の蛍光エネルギー移動を測定することにより、ラベル導入部位周辺のFE間相互作用を観測することを試みた結果、折り畳み反応開始後30μ秒以内に、DHFRのアデノシン結合サブドメインの構造がコンパウトになっているのに対し、ループ・サブドメインはやや広がった構造をしていることが示唆された。2.FE間相互作用の効率的な形成方法の探索:FEの連結方法、FE間リンカーにおける制約を調べることを目指して研究を行った。DHFRを3つのブロックに分け、それらの連結順序を様々に変えた変異体を作成し、蛋白質の構造形成能を調べた結果、蛋白質がfoldableになるためには、FEの連結順序に制約があること、また、FE間リンカー長が可変であることなどが明らかになった。