巨大粒子ボールトの機能解析

細胞内でRNAと相互作用するvaultの機能を評価するため,本年度はRNAiのアプローチを用いて実験を行った。先ず,ヒトリンパ腫U937細胞よりトータルRNAを調製した後,既に単離され,vaultとの相互作用が知られているRNA-1,RNA-2およびRNA-3に特異的なプライマーを用いてPCR法によって増幅し,それらRNAの全長の塩基配列を決定した。ざらに,vault-RNA複合体内の2カ所に対して特異的なRNAiオリゴをデザインし,ヒトリンパ腫U937細胞内でのvault-RNA発現をノックダウンにより行った。これらの合成RNAiオリゴはリポフェクタミン試薬を用いてヒトリンパ腫U937細胞に導入するが,コントロールのRNAiを用いた同様の実験と比較検討するとこにより,ノックダウン後も遊離もしくは結合しているRNAの量を測定した。この結果,VaUltより発現しているRNAは1種類,つまりRNA-1のみであることが明らかになった。そこで,RNA-1の配列から2つの領域を選択し,RNAi法に用いる2種類のRNAiオリゴをデザインし,このRNAiを細胞内で発現するためにpSilencerベクターを構築したまた。このベクターを用いて細胞内にトランスフェクトするとU6プロモーターより特定のRNAiが発現する。また,このベクターはプロマイシン耐性を保持するため,トランスフェクトした後の細胞をプロマイシンプレート上で培養することにより適当な細胞を選択できる。コントロールも含め,数種類のRNAiの発現を,それに伴うvault-RNAの阻害と共に解析し,U937細胞株において,RNAi法を用いて検定したものは,コントロールに比べ50%の阻害が確認された。しかし,この実験では,vaultRNAの発現量が少なく,有効な細胞株ではないことがわかった。今後は,さらに高い耐性をもつ細胞株を開発し,これらの細胞株を用いて実験を行う予定である。

細胞内でRNAと相互作用するvaultの機能を評価するため,本年度はRNAiのアプローチを用いて実験を行った。先ず,ヒトリンパ腫U937細胞よりトータルRNAを調製した後,既に単離され,vaultとの相互作用が知られているRNA-1,RNA-2およびRNA-3に特異的なプライマーを用いてPCR法によって増幅し,それらRNAの全長の塩基配列を決定した。ざらに,vault-RNA複合体内の2カ所に対して特異的なRNAiオリゴをデザインし,ヒトリンパ腫U937細胞内でのvault-RNA発現をノックダウンにより行った。これらの合成RNAiオリゴはリポフェクタミン試薬を用いてヒトリンパ腫U937細胞に導入するが,コントロールのRNAiを用いた同様の実験と比較検討するとこにより,ノックダウン後も遊離もしくは結合しているRNAの量を測定した。この結果,VaUltより発現しているRNAは1種類,つまりRNA-1のみであることが明らかになった。そこで,RNA-1の配列から2つの領域を選択し,RNAi法に用いる2種類のRNAiオリゴをデザインし,このRNAiを細胞内で発現するためにpSilencerベクターを構築したまた。このベクターを用いて細胞内にトランスフェクトするとU6プロモーターより特定のRNAiが発現する。また,このベクターはプロマイシン耐性を保持するため,トランスフェクトした後の細胞をプロマイシンプレート上で培養することにより適当な細胞を選択できる。コントロールも含め,数種類のRNAiの発現を,それに伴うvault-RNAの阻害と共に解析し,U937細胞株において,RNAi法を用いて検定したものは,コントロールに比べ50%の阻害が確認された。しかし,この実験では,vaultRNAの発現量が少なく,有効な細胞株ではないことがわかった。今後は,さらに高い耐性をもつ細胞株を開発し,これらの細胞株を用いて実験を行う予定である。