巨大粒子ボールトの機能解析

巨型粒子库的功能分析

• 批准号: 18054036
• 负责人: PENMETCHA Kumar
• 金额: $ 3.78万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18054036/
• 关键词: 核酸; タンパク質

細胞内でRNAと相互作用するvaultの機能を評価するため,本年度はRNAiのアプローチを用いて実験を行った。先ず,ヒトリンパ腫U937細胞よりトータルRNAを調製した後,既に単離され,vaultとの相互作用が知られているRNA-1,RNA-2およびRNA-3に特異的なプライマーを用いてPCR法によって増幅し,それらRNAの全長の塩基配列を決定した。ざらに,vault-RNA複合体内の2カ所に対して特異的なRNAiオリゴをデザインし,ヒトリンパ腫U937細胞内でのvault-RNA発現をノックダウンにより行った。これらの合成RNAiオリゴはリポフェクタミン試薬を用いてヒトリンパ腫U937細胞に導入するが,コントロールのRNAiを用いた同様の実験と比較検討するとこにより,ノックダウン後も遊離もしくは結合しているRNAの量を測定した。この結果,VaUltより発現しているRNAは1種類,つまりRNA-1のみであることが明らかになった。そこで,RNA-1の配列から2つの領域を選択し,RNAi法に用いる2種類のRNAiオリゴをデザインし,このRNAiを細胞内で発現するためにpSilencerベクターを構築したまた。このベクターを用いて細胞内にトランスフェクトするとU6プロモーターより特定のRNAiが発現する。また,このベクターはプロマイシン耐性を保持するため,トランスフェクトした後の細胞をプロマイシンプレート上で培養することにより適当な細胞を選択できる。コントロールも含め,数種類のRNAiの発現を,それに伴うvault-RNAの阻害と共に解析し,U937細胞株において,RNAi法を用いて検定したものは,コントロールに比べ50%の阻害が確認された。しかし,この実験では,vaultRNAの発現量が少なく,有効な細胞株ではないことがわかった。今後は,さらに高い耐性をもつ細胞株を開発し,これらの細胞株を用いて実験を行う予定である。

The function of vaults in intracellular RNA interactions has been evaluated, and RNAi has been successfully used this year. After RNA modulation in U937 cells, isolation and vault interactions were identified among RNA-1,RNA-2 and RNA-3 specific RNA molecules. PCR was used to amplify and determine the full-length nucleotide alignment of RNA. In addition, two genes in the vault-RNA complex target specific RNAi expression in U937 cells. The amount of RNA bound to U937 cells was determined by comparing the results of the synthetic RNAi assay with those of U937 cells. As a result,Vault Therefore, two areas of RNA-1 alignment were selected, and two types of RNAi were used in RNAi methods to develop RNAi. This RNAi can be detected in cells, and pSilencer is built. This is the first time that a specific RNAi has occurred in a cell. The cells were cultured in vitro and maintained in vitro. Several types of RNAi were detected in U937 cell line, and 50% of RNAi was detected by RNAi assay. There is a small amount of vaultRNA in the cell line. In the future, high tolerance cell lines will be developed, and the use of these cell lines will be determined.