構造変化感受性蛍光タンパク質を用いたTrk受容体リン酸化のライブイメージング

使用构象变化敏感荧光蛋白对 Trk 受体磷酸化进行实时成像

• 批准号: 19037001
• 负责人: 谷 知己
• 金额: $ 2.88万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19037001/
• 关键词: ライブイメージング; 蛍光顕微鏡; 蛍光タンパク質; 神経栄養因子; チロシンキナーゼ型受容体; 蛍光観察; GFPテクノロジー; タンパク質構造変化; 神経軸索伸長

膜タンパク質TrkAは広く神経細胞に発現し、代表的な神経栄養因子である神経成長因子NGFの受容体として、脳神経発生の制御に不可欠のタンパク質である。NGFの結合に伴うこのタンパク質の活性化を可視化する目的で、構造変化依存的に蛍光強度を変化する円順列変異蛍光タンパク質を、構造解析から予想されるTrkA受容体の活性化依存的な構造変化部位5カ所に挿入した変異遺伝子を作成し、この遺伝子を発現させたHeLa細胞およびPC12細胞を蛍光顕微鏡で観察した。作成した遺伝子のうち、HeLa細胞膜に発現したものは、受容体C末端近傍のkpnI切断部位とC末端に蛍光タンパク質を導入したもののみであったので、これらの部位にさまざまな蛍光タンパク質変異体遺伝子を導入した遺伝子を構築し、これらの遺伝子を発現したHeLa細胞およびPC12細胞に蛍光標識NGFを投与し、細胞表面へのNGF結合量と強制発現したTrkA-GFPの発現量との相関を調べた。不思議なことに、NGF結合とTrkA-GFPの発現量の相関は、HeLa細胞とPC12細胞で得られた結果が異なり、TrkA-GFPの発現量に対して結合したNGF量をプロットした回帰直線の傾きは、PC12細胞で得られたものが、HeLa細胞で得られたもののおよそ10倍となった。このことは、HeLa細胞で発現したTrkA-GFPは、NGF結合能が低下している事を示している。PC12細胞に2nMのNGFを投与して、発現させたTrkA-GFPの蛍光強度を経時的に計測した結果、NGF投与からの時間に従い、蛍光強度が低下する現象を発見した。この蛍光強度の時間変化を1次の指数関数でフィットすると、その時定数は172sとなった。この値は、後根節神経細胞成長円錐におけるNGF取り込みの1分子観察から推定された、TrkA活性化の時間経過とよく一致した。

The membrane is sensitive to TrkA, the growth factor, the growth factor and the growth factor. The combination of the NGF method and the activation device can make the purpose of the device, the dependence of the intensity of the light, the intensity of the device, the structure of the device, the structure of the capacitor, the active and dependent part of the TrkA receptacle, the device, the capacitor, the capacitor You can see HeLa cells, PC12 cells, light, etc. Make the membrane of the HeLa cell, the membrane of the receptacle, the C-terminal of the receptacle near the cut-off part of the kpnI, the light of the C-terminal of the receptacle, and the body of the receptacle. In this way, we can see that HeLa cells are sensitive to NGF, and that the amount of NGF on the surface of the cells is different from that of the TrkA-GFP cells. Do not consider the combination of NGF, NGF, PC12, TrkA-GFP, PC12, and NGF, respectively. The combination of TrkA-GFP and NGF can show the difference between the two groups in order to show the difference between the two. The PC12 cell compares the results of the NGF input and output, the calculation results of the TrkA-GFP light intensity threshold, the time response of the NGF input and the transmission time, and the response of the low light intensity. Change the light intensity time to change the number of times, and the number of times, 172s. The cell length of the cell is long-term, and the molecular weight of the NGF is consistent with that of the TrkA activation time.

项目成果

Trapping single molecules of GFP-tagged nerve growth factor receptor vialigands immobilized on a solid surface

捕获固定在固体表面上的 GFP 标记神经生长因子受体配体的单分子

• 发表时间: 2008
• 作者: Tomomi Tani;Kenta Saito and Takeharu Nagai
• 通讯作者: Kenta Saito and Takeharu Nagai

リガンド結合にともなう神経成長因子受容体TrkAの構造ダイナミクスを可視化する試み

尝试可视化配体结合后神经生长因子受体 TrkA 的结构动力学

• 发表时间: 2007
• 作者: Tomomi Tani;Kenta Saito and Takeharu Nagai;谷知己・斉藤健太・永井健治
• 通讯作者: 谷知己・斉藤健太・永井健治

A mercury arc lamp-based multi-color confocal real time imaging system for cellular structure and function

基于汞弧灯的细胞结构和功能多色共焦实时成像系统

• 发表时间: 2008
• 期刊: Cell Structure Function 33
• 作者: Saito K;Kobayashi K;Tani T;Nagai T
• 通讯作者: Nagai T

スパイは一人で充分-蛍光タンパク質を用いた蛍光1分子イメージング(分担執筆)

一个间谍就足够了——使用荧光蛋白的荧光单分子成像（合著者）

• 发表时间: 2007
• 作者: Tomomi Tani;Kenta Saito and Takeharu Nagai;谷知己・斉藤健太・永井健治;野村真未・原田慶恵・谷知己;谷知己・永井健治
• 通讯作者: 谷知己・永井健治

切断された神経軸索の再生における神経成長因子の作用.

神经生长因子对切断的神经轴突再生的影响。

• 发表时间: 2007
• 作者: 横田 浩章;横田 浩章;岡部 弘基;山岸 舞;中条 裕子;横田 浩章;加藤 悠子;野村 真未
• 通讯作者: 野村 真未