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高速ＡＦＭ　／　蛍光顕微鏡複合機による生体分子の動態解析

使用高速 AFM/荧光显微镜复合体进行生物分子动态分析

基本信息

批准号：
14J05613
负责人：
福田真悟
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度に開発した高速AFM / 蛍光顕微鏡画像相関法を用いてγサブユニットを取り除いたF1-ATPase(α3β3複合体)の構造変化と蛍光ATPの同時観察を行った。しかし、高速AFMと蛍光顕微鏡の空間分解能の違いから、ヌクレオチドの結合/解離とそれに伴ったβサブユニットの構造変化を明確に捉えることができず、詳細な化学/力学変換メカニズムを議論することができなかった。そこで、光の回折限界を超える空間分解能を有する走査型近接場光顕微鏡と高速AFMを組み合わせた高速AFM / 超解像光学顕微鏡複合機の開発を行った。アバランシェフォトダイオードを使い、蛍光を計測し光学像を構築した。Igor Pro(Wave Metrics)とC言語を用いて探針の位置と同期して蛍光を検出しAFM像と光学像を同時に取得することができるイメージングソフトウェアを開発した。探針の金属修飾法は、アミンの光還元反応を利用して探針を銀ナノ粒子でコーティングした。この手法で作製した探針では、銀で薄膜コーティングした探針と比べて約6倍の散乱光強度を達成することができた。直径40 nmの蛍光ビーズを高速AFM/光学同時イメージングした結果、イメージングレート3.5秒で光の回折限界を大きく上回る87 nmの超解像光学イメージングに成功した。このイメージングスピードは、報告されている走査型近接場光顕微鏡を用いた結果と比べて100倍以上速いスピードである。しかしながら、銀粒子が探針の先端全体を覆っているため、AFMの空間分解能が大きく低下してしまった。このことが、大きな電場増強を達成しているにもかかわらず光学像において、空間分解能が制限されている要因だと考えられる。今後は、探針に銀粒子をコーティングした後に、短い探針を製作するなどの探針作製法を改良していく予定である。

In the past year, the development of high-speed AFM /fluorescence micro-mirror image correlation method has been used to extract the structure of F1-ATPase(α3β3 complex) and to detect ATP simultaneously. The spatial decomposition energy of high-speed AFM and optical micromirrors is discussed in detail. The development of high speed AFM /Super Resolution Optical Micromirror Complex has been carried out by combining high speed AFM with near field optical micromirrors. In the case of the optical system, the optical system can be used to measure and construct optical images. Igor Pro(Wave Metrics) and C speech probe position and synchronization, AFM image and optical image acquisition simultaneously. The metal modification method of the probe is used to modify the silver particles of the probe. This method of manufacturing a probe is about 6 times more intense than a silver film probe. 40 nm diameter optical fiber, high speed AFM/optical simultaneous detection results, detection results, 3.5 seconds, optical reflection limits, large return time, 87 nm super resolution optical fiber detection results successfully The results of the application of a walk-through near-field optical microscope are more than 100 times faster than those of the optical microscope. The tip of the probe is covered with silver particles, and the spatial resolution of AFM is greatly reduced. The spatial decomposition energy is limited by the increase of the electric field. In the future, the preparation method of silver probe particles will be improved.