腸内連鎖球菌ナトリウム輸送性V型ATPアーゼの分子機構の解明

阐明肠球菌钠转运V型ATP酶的分子机制

• 批准号: 19042022
• 负责人: 村田 武士
• 金额: $ 3.71万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19042022/
• 关键词: V-ATPase; X線結晶構造解析; ポンプ; ナトリウム; モーター; 複合体; 膜タンパク質; Enterococcus hirae

当初研究計画に従って、下記の研究結果を得た。下記番号は研究実施計画書の番号に対応させた。1) 前年度に開発した変異株作製系では発現量が少なく、変異酵素を完全精製することが難しかった。本年度、新規発現プラスミドを作製することにより本酵素変異株の大量発現及び大量精製系を確立することに成功した。2) Na^+結合型NtpKリングからNa^+を取り除いた構造の外側にNa^+を発生させてMDシミュレーションを行った。グルタミン酸残基にトラップされたNa^+イオンはNa^+結合ポケットに入り、Na^+結合型の結晶構造と類似した構造で安定化した。また、Li^+とH^+はリングに結合できるが、イオン半径が大きいK^+は結合できないことがわかった。3) 結晶化の精密化を行っているが、解像度の改善はみられなかった。結晶性が悪い原因としてV_1複合体からのサブユニット解離が示唆された。ATP、ADP存在下ではV_1部分はpHに依存してサブユニット解離が起るが、AMP-PNP存在下では安定化することがわかった。また、V_1部分に相当するサブユニットのうちNtpA、NtpB、NtpE、NtpFサブユニットそれぞれの大腸菌大量発現系を確立し、各サブユニットの生化学的性質を調べた。4) V_1-ATPaseの構造が得られていないのでF_1-ATPaseの計算機シミュレーションを進めた。分子動力学法/自由エネルギー計算によりβサブユニットの構造変化とγサブユニットの回転を共役する役目を持つと考えられているDELSEED配列(Asp394〜Asp400)付近の構造を観察したところ、基質変換に伴い構造変化が確認された。すなわち、DELSEED配列近傍のPhe418〜Gly426は、触媒反応と構造変化、回転を共役するのに重要な残基であることか示唆された。

The original research plan was completed and the results of the study were recorded below. The following is a summary of the study plan. 1)In the past year, the production of different enzymes has been reduced, and it is difficult to completely purify them. This year, new regulations were developed to control the production of large quantities of mutant strains of this enzyme and to establish a large number of purification systems. 2)Na^+-bound NtpK molecules are selected from the outer layers of the structure and produced in the MD system. Na ^+-bound crystalline structure and stabilization of Na^+-bound crystalline structureまた、Li^+とH^+はリングに结合できるが、イオン半径が大きいK^+は结合できないことがわかった。3)Crystallization and refinement, resolution and improvement Crystallization is the cause of V_1 complex dissociation. In the presence of ATP and ADP, the V_1 part is pH dependent, and in the presence of AMP-PNP, it is stable. A large number of E. coli production systems were established and biochemical properties of the three components were adjusted. 4)The structure of V_1-ATPase was studied in detail, and the computer system of F_1-ATPase was developed. Molecular dynamics/free radical calculation for structural transformation of βPhe418 ~ Gly426 near the DELSEED alignment are important residues for structural transformation and regression.

项目成果

V-ATPaseの新しい機能とその構造からみえてきたメカニズム

V-ATP酶的新功能及其结构揭示的机制

• 发表时间: 2007
• 期刊: 蛋白質核酸酵素 52
• 作者: 村田 武士;山登 一郎;柿沼 喜己;横山 謙
• 通讯作者: 横山 謙

液胞型イオン輸送ATPアーゼの分子制御とメカニズム

液泡离子转运ATP酶的分子调控及机制

• 发表时间: 2007
• 作者: 村田武士;山登一郎;柿沼喜己
• 通讯作者: 柿沼喜己

Ion binding and selectivity of the rotor ring of the Na+-transporting V-ATPase

• DOI: 10.1073/pnas.0800992105
• 发表时间: 2008-06-24
• 期刊: PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA
• 影响因子: 11.1
• 作者: Murata, Takeshi;Yamato, Ichiro;Iwata, So
• 通讯作者: Iwata, So

ION BINDING AND SELECTIVITY OF THE ROTOR OF THE V-TYPE NA+-ATPASE FROM ENTEROCOCCUS HIRAE

海拉肠球菌V型NA-ATP酶的离子结合和转子选择性

• 发表时间: 2007
• 作者: 村田武士;山登一郎;柿沼喜己;Takeshi Murata
• 通讯作者: Takeshi Murata

Stoichiometry and solution structure of the peripheral stalk subunits of Enterococcus hirae V-ATPase

希拉肠球菌 V-ATP 酶外周柄亚基的化学计量和溶液结构

• 发表时间: 2008
• 作者: Yamamoto M;Unzai S;Saijo S;Ito K;Mizutani K;Kakinuma Y;Yokoyama S;Yamato I,Iwata S;Murata T.
• 通讯作者: Murata T.