RNA合成における翻訳因子の役割の解明

阐明翻译因子在 RNA 合成中的作用

• 批准号: 20051030
• 负责人: 富田 耕造
• 金额: $ 4.22万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20051030/
• 关键词: RNA合成; 翻訳因子; 構造解析; 複合体; RNA依存性RNA合成酵素; 結晶構造

Qβファージの複製酵素はQβファージ自身のRNAゲノムにコードされているβサプユニット(レプリケース)の他に宿主である大腸菌由来の翻訳伸長因子であるEF-Tu、EF-Ts、リボゾーマルタンパク質S1を含む複合体である。我々は、Qβファージ由来のRNA依存性RNA合成酵素(RNA dependent RNA polymerase : RdRp)であるQβ複製酵素複合体のX線結晶構造解析、機能解析を通して、RNA合成における翻訳因子の役割、そして、RNA依存性RNA合成酵素のRNA合成の動的分子基盤を明らかにすることを目的として研究を進めている。本申請課題にて、レプリケース、EF-Tu、EF-Ts三者複合体と、レプリケース、EF-Tu、EF-Ts、S1四者複合体を複合体として大腸菌にて大量に発現、精製するスキームを試みてきた。EF-Tu、EF-Ts、S1四者複合体に関して結晶が得られたが、十分な分解能が得られる良質な結晶ではなく、また結晶化の再現性も得られなかった。そこで、レプリケース、EF-Tu、EF-Tsをアミノ酸リンカーでつないだタンパク質の精製、結晶化を試みた。この一本鎖にしたタンパク質は、通常のEF-Tu、EF-Tsの三者複合体と同様に、34ヌクレオチドのモデルRNAを鋳型として、それに相補的なRNAを合成できることを確認している。そこで、一本鎖にしたタンパク質を大量に発現し、精製するスキームを確立し、結晶化を行ったところ、PEG400を沈殿剤とした条件で良質な結晶を再現性よく、確実に得ることができた。つくばの放射光施設Photon FactolyのビームラインBL-17AでX線回折実験を行い、分解能2.8Åでデータ収集を行った。空間群はC222_1であり、格子定数はa=139.9Å、b=250.1Å、c=101.2Åであった。セレノメチオニン置換体タンパク質をもちいて結晶化を行い、得られた結晶を用いてMAD法によって3.1Åの分解能で位相の決定に成功した。現在、モデル構築、精密化を行っている段階である。今後、得られた構造から、QβレプリケースによるRNA合成の分子基盤の一端が明らかにされると期待している。

Qβ-DNA replicase converts Qβ-DNA into its own RNA, which is a complex of EF-Tu, EF-Ts, EF-Ts, EF-S1 and other E. coli-derived replicase elongation factors. We are continuing our research on the X-ray crystallographic analysis and functional analysis of the Qβ replicase complex, the cleavage of transcription factors during RNA synthesis, and the molecular basis for the activation of RNA dependent RNA polymerase (RdRp). The subject of the present application is a three-part complex of E. coli, EF-Tu and EF-Ts, and a four-part complex of E. coli, EF-Tu and EF-Ts. EF-Tu, EF-Ts, S1 four-component complexes are related to crystallization, decomposition, and reproducibility. For example, if you are interested in the preparation of the film, you can use the following methods to prepare the film: This is the first time we have identified the type of RNA synthesis that is complementary to EF-Tu and EF-Ts in general. The quality of PEG 400 is high, and the reproducibility of PEG400 is high. Photon FactolyTM BL-17A X-ray reflection test, resolution energy 2.8 ° C X-ray collection test Space group C222_1, lattice fixed number a=139.9, b=250.1, c=101.2. The method of determining the phase of the crystal is described in detail below. Now, the structure of the structure, precision, the stage of the process. In the future, we will have to look forward to the future of RNA synthesis at one end of the molecular base.

项目成果

アミノアシルtRNA蛋白質転移酵素の基質認識、反応触媒の分子機構の解明

阐明氨酰-tRNA蛋白转移酶底物识别和反应催化的分子机制

• 发表时间: 2009
• 期刊: 生化学、日本生化学会 81
• 作者: 渡邉和則;董雪松;富田耕造
• 通讯作者: 富田耕造

Conserved Cysteine Residues of GidA Are Essential for Biogenesis of 5-Carboxymethylaminomethyluridine at tRNA Anticodon

• DOI: 10.1016/j.str.2009.03.013
• 发表时间: 2009-05-13
• 期刊: STRUCTURE
• 影响因子: 5.7
• 作者: Osawa, Takuo;Ito, Koichi;Numata, Tomoyuki
• 通讯作者: Numata, Tomoyuki

Mechanism for the definition of elongation and termination by the class II CCA-adding enzyme

• DOI: 10.1038/emboj.2009.260
• 发表时间: 2009-11-04
• 期刊: EMBO JOURNAL
• 影响因子: 11.4
• 作者: Toh, Yukimatsu;Takeshita, Daijiro;Tomita, Kozo
• 通讯作者: Tomita, Kozo

tRNAを使うリボソームによらないペプチド結合形成反応

使用 tRNA 进行不依赖核糖体的肽键形成反应

• 发表时间: 2008
• 期刊: 蛋白質核酵素 53
• 作者: 渡邉和則;富田耕造
• 通讯作者: 富田耕造

クラスII CCA付加酵素によるRNA合成伸長-終結を規定する分子メカニズム

II类CCA添加酶调节RNA合成延伸-终止的分子机制

• 发表时间: 2009
• 作者: 董雪松;竹下大二郎;富田耕造
• 通讯作者: 富田耕造