独立栄養細菌(Thiobacillus属)の宿主・ベクター系の開発

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1.Thiobacillus属細菌の固体培養法の開発:T.ferrooxidansAP19-3株、T.thiooxidans ON106の株の両株を、Silvermanの9K基本培地にエネルギー源として、それぞれ3%FeSO_4及びコロイド硫黄を用いて、ゲル化剤としてアガロース及びゲランガムを使用して固体培養を行い、良好なコロニーを形成させることが出来た。2.ベクターの開発:AP19-3株及びON106株のプラスミドの存在について検討した結果、前者には9.1Kbのプラスミド(pTF1)が存在した。制限酵素地図を作成したところ、EcoR1とPstIの2種の制限酵素による単一切断部位を有していた。そこでpTF1のEcoRI切断部位にpUC19を連結し、ハイブリドプラスミド(pTF101、11.8Kb)を作成した。後者もプラスミドを保有していると推測されたので、1)で確立した固体培養法を用いてsingle cellよりプラスミド(pTT1)を単離した。現在制限酵素地図を作成中である。シャトルベクター構築のためには、協力なプロモーターが必要である。そこで大腸菌のプロモーター検索用プラスミド(pMC1403)を用い、AP19-3株のプロモーター遺伝子のクローニングを行った。その結果、10数株のプロモーター領域挿入プラスミドが得られた。これらの株よりプラスミドを単離し、分析したところ様々の長さのフラグメントが挿入されていることが確立されたので、今後更に小型化し、プロモーター活性の検討や塩基配列の決定を行いたい。3.Thiobacillus属細菌の宿主としての可能性の検討:両菌株について制限・修飾系を検討した結果、ON106株に制限・修飾系の存在が認められた。一方、AP19-3株には制限・修飾系が認められず宿主として使用可能と考えられた。また、同菌株についてスフェロプラスト化の条件を確立することが出来たので、今後、形質転換に利用出来ると考えられる。