好熱性古細胞における宿主ベクター系の開発

嗜热古细胞宿主载体系统的开发

基本信息

批准号：
04680185
负责人：
山岸明彦
金额：
--
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1 1)まず超好熱性古細菌スルホロバスにおいて、カルシウム法による形質転換の検討を行った。スルホロバスのウラシル要求性株を培養し、いくつかの条件でカルシウムによる処理をおこなったのち、野生型株の染色体DNAと混合し、いくつかの条件で放置の後最少培地上にプレートした。復帰変異効率を大きく上回る形質転換効率は得られず、電気穿孔法による形質転換が必要であることが明かとなった。2)同時に好熱性古細菌サーモプラズマの野生型株を、いくつかの条件で培養の後に、ノボビオシン耐性株の染色体DNAと混合放置の後、ノボビオシンプレートで形質転換株を同定した。やはり有為な形質転換株は得られなかった。3)スルホロバスにおいて、電気穿孔法による形質転換を試みた。ある条件下で、形質転換株と思われるコロニー数の増加が認められた。今後の検討が必要であるが今後この方法での形質転換は有望と思われる。2 1)マーカーとして利用可能な遺伝子として、5-フルオロオロト酸耐性に関与している遺伝子pyrEのクローニングのために、高度好熱菌サーマスにおいてpyrE遺伝子を発現スクリーニングするためのベクターを作成した。2)サーモプラズマのプラズミドの一部を大腸菌内にクローニングし、その塩基配列を決定した。少なくとも 128残基のオープンリーディングフレームが存在した。プラズミドの複製等になんらかの役割を持っている可能性がある。3)決定された塩基配列を元にプライマーを作成し、PCRによって低能度のプラズミドを増幅検出することが出来た。これをマーカーとして用いることが出来る。以上、電気穿孔法による形質転換法の検討、マーカーの作成ともに、半年の研究期間での目標は100%達成した。

1 1）首先，通过钙方法研究了转化的过度疗法古细菌磺胺硫。培养了尿氨基菌株的磺胺菌株，在几种条件下用钙处理，然后与野生型菌株的染色体DNA混合，留在几种条件下，并将其镀在最小培养基上。据显示，没有获得明显大于回归效率的转化效率，并且需要通过电穿孔转换。 2）同时，在几种条件下培养了嗜热古细胞热质量的野生型菌株，并与耐新生剂抗性菌株的染色体DNA混合，并在Novobiosin plates中鉴定出转化的菌株。正如预期的那样，未获得有效的转化体。 3）在磺洛洛娃中尝试通过电穿孔进行转化。在某些条件下，观察到被认为是转化菌株的菌落数量的增加。需要未来的考虑，但是使用这种方法的转换似乎是有希望的。 2 1）作为一个可以用作标记的基因，创建了一个载体来筛选高度嗜热细菌热素中的Pyre基因的表达，以用于pyre的克隆，这是一种参与5-氟甲甲甲基耐药性的基因。 2）将热质量的一部分克隆到大肠杆菌中，并确定其碱基序列。有一个至少128个残基的开放式阅读框。 3）基于确定的碱基序列创建引物，并允许PCR放大和检测低效率质粒。这可以用作标记。在六个月的研究期间，实现了电穿孔转化方法研究和创建标记的上述目标。