好熱性古細胞における宿主ベクター系の開発

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1 1)まず超好熱性古細菌スルホロバスにおいて、カルシウム法による形質転換の検討を行った。スルホロバスのウラシル要求性株を培養し、いくつかの条件でカルシウムによる処理をおこなったのち、野生型株の染色体DNAと混合し、いくつかの条件で放置の後最少培地上にプレートした。復帰変異効率を大きく上回る形質転換効率は得られず、電気穿孔法による形質転換が必要であることが明かとなった。2)同時に好熱性古細菌サーモプラズマの野生型株を、いくつかの条件で培養の後に、ノボビオシン耐性株の染色体DNAと混合放置の後、ノボビオシンプレートで形質転換株を同定した。やはり有為な形質転換株は得られなかった。3)スルホロバスにおいて、電気穿孔法による形質転換を試みた。ある条件下で、形質転換株と思われるコロニー数の増加が認められた。今後の検討が必要であるが今後この方法での形質転換は有望と思われる。2 1)マーカーとして利用可能な遺伝子として、5-フルオロオロト酸耐性に関与している遺伝子pyrEのクローニングのために、高度好熱菌サーマスにおいてpyrE遺伝子を発現スクリーニングするためのベクターを作成した。2)サーモプラズマのプラズミドの一部を大腸菌内にクローニングし、その塩基配列を決定した。少なくとも 128残基のオープンリーディングフレームが存在した。プラズミドの複製等になんらかの役割を持っている可能性がある。3)決定された塩基配列を元にプライマーを作成し、PCRによって低能度のプラズミドを増幅検出することが出来た。これをマーカーとして用いることが出来る。以上、電気穿孔法による形質転換法の検討、マーカーの作成ともに、半年の研究期間での目標は100%達成した。