高度好熱菌の宿主・ベクター系の改良と好熱菌内での酵素の進化工学的耐熱化

高度嗜热细菌宿主-载体系统的改进以及嗜热细菌中酶的进化工程，使其更加耐热

• 批准号: 08780565
• 负责人: 玉腰 雅忠
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08780565/
• 关键词: 高度好熱菌; 宿主ベクター系; 進化工学; イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ

1.高度好熱菌の遺伝子操作系の改良高度好熱菌のためのインテグレーションベクターの改良を行い、それを用いて耐熱性の低い大腸菌由来イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(IPMDH)を高度好熱菌内で発現させることに成功した。このベクターを用いると開始コドンをあわせることによりどのような遺伝子も染色体に挿入可能となり、多くの酵素の進化工学的耐熱化を可能とした。また、ピリミジン合成系にかかわるpyrE遺伝子が高度好熱菌でもマーカーとして使えることを初めて示した。更にロイシン合成系オペロンの配列をもち、一回相同組換えによる新しいインテグレーションベクターを作製した。このベクターを用いると外来遺伝子の発現が可能となる事は勿論、遺伝子の回収のために染色体DNAを調整後、適当な制限酵素処理の後自己結合することにより容易に大腸菌内にクローニングできるようなデザインとなっている。これらの改良型インテグレーションベクターを用いて、中等度好熱菌である程度耐熱化されたカナマイシン不活性化酵素の発現に成功し、高度好熱菌を用いて更に耐熱化するため系を作製した。2.酵素の進化工学的耐熱化1.で得られた大腸菌IPMDHを発現する好熱菌は選択培地上で53℃では生育できたが、その産物の耐熱性が低いために60℃で生育できなかった。その株を出発として自然に起きる突然変異により60℃でも生育可能となった株(EN604)、それを出発として更に耐熱化させ、65℃でも生育可能となった株(EST661)を得ることに成功した。これらの株から大腸菌IPMDHをコードする遺伝子を回収し、塩基配列解析を行ったところ、EN604ではN末端から106番目のアミノ酸残基であるセリンがイソロイシンに変わるような変異が起きていた(AGC→ATC)。この部位は活性中心をはさんだ二つのドメインを結ぶヒンジ領域にある。またEST661ではIPMDH遺伝子の上流にある別の遺伝子(leuD)上に5塩基の重複が観察された。

1. The height of the bacteria is good. The operation system is to improve the height of the bacteria. The bacteria are highly tolerated. The bacteria are low, and the bacteria are not tolerated. The bacteria are highly stable. The bacteria in the bacteria are highly efficient. The bacteria in the bacteria are highly efficient, and the bacteria are successful. In order to improve the stability of chemical engineering, it is possible that the chromosomes of human chromosomes are introduced into the chemical engineering system. The synthetic system is very high, and the pyrE is very high. The bacteria are very high. More importantly, the synthesis system should be equipped with the same system, and the same system should be used in the same way. It is possible that when you use a foreign drug, you may not be able to talk about it. After the DNA of the chromosome is adjusted, and after the restriction of enzymes is processed, it is easy to treat the bacteria in the bacteria. In this case, the improved type is not suitable for use, and the medium grade is good. The degree of tolerance of the bacteria is low. The inactivating enzyme is successful, and the highly good bacteria are more resistant. two。 Endurance of enzyme evolution in chemical engineering 1. It was found that the bacteria IPMDH could grow at 53 ℃, grow at 60 ℃, and grow at 60 ℃ for low tolerance. All of a sudden, all of a sudden, it is possible to have a baby at 60 ℃. It is possible to have a baby (EN604), to be more tolerant, and to have a baby at 65 ℃. It is possible to have a successful baby (EST661). The strain of IPMDH was isolated from the fungus, the bacteria were isolated from the fungus, and the nucleotides were analyzed by AGC column analysis. The results showed that there was no acid residue in the N-terminal of the EN604. The active center, the active center and the active center. "EST661", "IPMDH", "high-end", "5" base weight, "leuD", "5" base weight, "check".