ケージドmRNA技術とノックダウン法による前脳形成遺伝子間相互作用の解明

使用笼状 mRNA 技术和敲低方法阐明前脑形成基因相互作用

• 批准号: 15011262
• 负责人: 安藤 秀樹
• 金额: $ 3.2万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15011262/
• 关键词: ゼブラフィッシュ; ケージドmRNA; Bhc-diazo; lh2a; 遺伝子発現; 遺伝子間相互作用

1.Bhc-diazoによるケージドmRNAの合成法の確立と応用:新規に開発されたケージド試剤Bhc-diazoをmRNAのリン酸基に結合させることにより、両者の複合体(ケージドmRNA)の効率的合成系の確立に成功した。ケージドmRNAは構造上翻訳が不能であるが、低線量の紫外線照射によるBhc基の解離により通常のmRNAに戻り、翻訳活性を回復する。本原理を応用し、試験管内で合成した任意の遺伝子に対応するmRNAをケージし、ゼブラフィッシュ受精卵に導入後任意の発生段階に任意の部位に紫外線スポット光を瞬間照射することで標的部位に特異的翻訳誘導をなし、「時空間特異的遺伝子発現誘導系」の開発に成功した。2.上記の実験系を用いて転写制御因子Engrailed(En)の前脳特異的過剰発現を行った結果、中脳領域の著明な拡張と終脳および間脳領域の縮小が観察され、Enの前脳テリトリー確立への具体的関与が示唆された。3.次に本法とアンチセンスモルフォリノオリゴヌクレオチド(AMO)の併用により、前脳形成に関与する複数の遺伝子群の機能的相互作用解明のアプローチを行った。すなわち密接な機能的関連が示唆される2種の遺伝子の一方をAMO法で機能阻害した個体に同時に導入した他方の遺伝子に対応するケージドmRNAを適切な時期および部位に翻訳誘導し、機能阻害効果を救出するか否かを判定した。もし救出効果が再現されれば翻訳誘導された遺伝子産物は機能阻害された遺伝子の機能的下流に位置する可能性が高く、対象実験として機能阻害される遺伝子と翻訳誘導される遺伝子を入れ替えた実験で救出効果が認められなければ上記の可能性の裏付けとなる。本実験系により、前脳形成において2種の転写因子(six3とlh2a)の間でSix3がLh2aの機能的上流で働くことを示すことができた。

1. Establishment and application of synthesis method of Bhc-diazo mRNA: new method for developing Bhc-diazo mRNA binding system of Bhc-diazo mRNA complex (Bhc-diazo mRNA). The structure of the mRNA can not be changed, and the Bhc base can be dissociated by low amount of ultraviolet radiation, and the normal mRNA can be changed. This principle was successfully applied to the development of a time-space-specific gene expression induction system for the induction of specific gene expression in any part of the development stage after the introduction of fertilized eggs into the tube by instantaneous irradiation with ultraviolet light. 2. The above results indicate that the control factor Engrailed(En) has been used to write the control factor, and the specific relationship between Engrailed(En) and Engrailed (En) has been established. 3. This method is used to explain the interaction between the functions of multiple genetic subgroups related to the formation of the precursor and the combination of AMO. The AMO method is used to determine whether one of the two genes is related to the other gene and whether the gene is related to the other gene. The probability that the result of the rescue can be reproduced in the downstream position of the function of the gene is high, and the probability that the result of the rescue can be recognized in the downstream position of the function of the gene is high, and the probability that the function of the gene can be prevented is high. This is the first time that two kinds of writing factors (six3 and lh2a) are formed.

项目成果

Hideki Ando, Toshiaki Furuta, Hitoshi Okamoto: "Photo-mediated gene activation using caged mRNA in zebrafish embryos"Methods in Cell Biology. (in press). (2004)

Hideki Ando、Toshiaki Furuta、Hitoshi Okamoto：“在斑马鱼胚胎中使用笼中 mRNA 进行光介导的基因激活”细胞生物学方法。

安藤秀樹, 古田寿昭, 岡本仁: "新規ケージド化合物を用いた遺伝子の光によるスイッチオン/オフ技術"生化学. 75. 1251-1254 (2003)

Hideki Ando、Toshiaki Furuta、Hitoshi Okamoto：“使用新型笼状化合物的光诱导基因开关技术”《生物化学》75. 1251-1254 (2003)。

Hideki Ando, Hitoshi Okamoto: "Practical procedures for Bhc-diazo-caging of mRNA for ectopic induction of gene expression in zebrafish embryos"Methods in Cell Science. 25. 25-31 (2003)

Hideki Ando、Hitoshi Okamoto：“斑马鱼胚胎异位诱导基因表达的 Bhc-重氮笼养 mRNA 的实用程序”细胞科学方法。

Hitoshi Okamoto, Yoshikazu Hirate, Hideki Ando: "Systematic identification of factors in zebrafish regulating the early midbrain and cerebellar development by ordered differential display and caged mRNA technology"Frontiers in Bioscience. 9. 93-99 (2004)

Hitoshi Okamoto、Yoshikazu Hirate、Hideki Ando：“通过有序差异显示和笼养 mRNA 技术系统鉴定调节斑马鱼早期中脑和小脑发育的因子”生物科学前沿。