HIVインテグラーゼの機能ドメイン解析

HIV整合酶的功能域分析

• 批准号: 15019031
• 负责人: 増田 貴夫
• 金额: $ 3.33万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15019031/
• 关键词: HIV-1; インテグラーゼ; 核内移行; siRNA; レンチウイルスベクター; H1プロモーター; 逆転写反応; cDNA

(1)HIV-1インテグラーゼ変異体による解析:HIV-1ウイルスゲノム(cDNA)の核内輸送におけるインテグラーゼの機能的関与をウイルスcDNAとの結合能を低下させた変異体を用いて検討した。HIV-1インテグラーゼのウイルスcDNA結合に関与すると考えられているアミノ酸残基(PYNP:142-145位)および三つのリジン残基(KKK:156,157,160位)にアミノ酸置換あるいは欠損変異を導入した新たなHIV-1インテグラーゼの変異体を作製した。HIV-1インテグラーゼ蛋白の生化学的解析より、ウイルスcDNAとの結合能が著しく低下(野生型インチグラーゼ比で10%以下)する変異体(DPYNP, N144Q, KKK>AAA)を得た。これらの変異体のウイルス学的性状解析から、ウイルス感染性を顕著(親株比で1%以下)に低下させる変異体(DPYNP, N144Q, KKK>AAA)を得た。さらに、感染細胞の核分画中のウイルスcDNAの定量解析およびHIV-1特異的PNAプローブをもちいたFISH解析よりこれらの変異体のウイルスcDNAの核内移行過程が阻害されていることを確認した。以上の結果はインテグラーゼがウイルスゲノムの核内移行過程に関与する主要ウイルス因子であることを示すものと考えられる。(2)siRNA発現レンチウイルスベクターの開発:各宿主因子のHIV複製における機能的意義を検討するため、各因子欠損細胞株を樹立を目的としたsiRNA発現ベクターの開発を行った。レンチウイルスベクターを用いH1プロモーターの下流にヘアピン型siRNA(shRNA)を発現させた。このレンチウイルスベクターにより発現させたsiRNAの配列特異的抑制効果は、従来の合成siRNAあるいはベクター型siRNA発現系と比べて、その持続性(35日以上)および非分裂細胞への導入効果(90%抑制)といった点で優っていることを示した。Rch-1を標的としたsiRNAを導入させた293T細胞では,WB法量的(1/10)に低下した細胞株を得た。現在、siRNAによる他の宿主因子欠損株を樹立し、ウイルス感染各素過程への影響を検討している。

(1) Analysis of HIV-1 gene mutation: The relationship between HIV-1 gene mutation and the function of HIV-1 gene mutation (cDNA) in nuclear transport and its binding energy. HIV-1 cDNA binding is related to acid residues (PYNP: positions 142-145) and triple acid residues (KKK: positions 156, 157, 160). The biochemical analysis of HIV-1 gene protein and its cDNA binding energy were found to be lower (<10% of wild-type gene) and variant (DPYNP, N144Q, KKK>AAA). Analysis of the scientific characters of these mutants showed that their infectivity was lower than that of their parents (ratio of parents to plants less than 1%), and their mutants (DPYNP, N144Q, KKK>AAA) were lower than that of their parents. Quantitative analysis of HIV-1 cDNA in nuclear analysis of infected cells and FISH analysis of HIV-1 cDNA in nuclear analysis of infected cells These results indicate that the main factors affecting the nuclear migration process are: (2) Development of siRNA expression: The significance of HIV replication function of each host factor is discussed, and the purpose of establishment of cell lines deficient in each factor is discussed. The development of siRNA(shRNA) in the downstream of the virus The siRNAs were found to be sequence-specific inhibitors, and synthetic siRNAs were found to be sequence-specific siRNAs that were more stable than synthetic siRNAs and had a persistence (more than 35 days) and were introduced into non-dividing cells (90% inhibition). Rch-1-targeted siRNA was introduced into 293T cells and (1/10) lower cell lines were obtained. Now, siRNAs target other host factor-deficient strains to establish and investigate the effects of siRNAs on the process of infection.

项目成果

Suzuki Youichi: "Quantitative analysis of human immunodeficiency virus type 1 DNA dynamics by real-time PCR : Integration efficiency in stimulated and unstimulated peripheral blood mononuclear cells."Virus Genes. 27・2. 177-188 (2003)

铃木阳一：“通过实时 PCR 定量分析人类免疫缺陷病毒 1 型 DNA 动态：刺激和未刺激的外周血单核细胞的整合效率。”病毒基因 27・2 (2003)。

Nomura Machiko: "Repression of Tax expression is associated both with resistance of HTLV-1 infected T cells to Tax-specific cytotoxic T lymphocytes killing and with impaired tumorigenecity in a rat model."Journal of Virology. (in press).

Nomura Machiko：“Tax 表达的抑制与 HTLV-1 感染的 T 细胞对 Tax 特异性细胞毒性 T 淋巴细胞杀伤的抵抗力以及大鼠模型中的致瘤性受损有关。”病毒学杂志。

Hasegawa Atsuhiko: "Expansion of human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) reservoir in orally infected rats : inverse correlation with HTLV-1 -specific cellular immune response."Journal of Virology. 77・5. 2956-2963 (2003)

Atsuhiko Hasekawa：“口腔感染大鼠中人类 T 细胞白血病病毒 1 型 (HTLV-1) 储存库的扩展：与 HTLV-1 特异性细胞免疫反应呈负相关。”病毒学杂志 77・5。 2003）

Nishitsuji Hironori: "Expression of small interfering RNA by lentivirus-based vector confers efficient and stable gene-suppression of HIV-1 on human cells including primary non-dividing cells."Microbes and Infection. 6・1. 76-85 (2004)

Nishitsuji Hironori：“基于慢病毒的载体表达小干扰 RNA 可对人类细胞（包括原代非分裂细胞）进行有效且稳定的 HIV-1 基因抑制。”微生物与感染 76-85。

Liu Huining: "Suppression of HIV-1-replication by HIV-1-irrelevant CD8^+ cytotoxic T lymphocytes resulting in preservation of persistently HIV-1-infected cells in vitro."Viral Immunology. 16・3. 379-391 (2003)

刘慧宁：“HIV-1 无关的 CD8^+ 细胞毒性 T 淋巴细胞抑制 HIV-1 复制，导致体外持续保存 HIV-1 感染的细胞。”病毒免疫学 16・3 (2003)。 ）