概日リズムと発がん制御とのクロストークの研究

昼夜节律与癌变控制之间的串扰研究

• 批准号: 15023238
• 负责人: 八木田 和弘
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15023238/
• 关键词: 概日リズム; 体内時計; タンパク複合体; mPer2

本研究課題は、概日リズムと発がん制御とのクロストークの研究である。これまでの研究で、時計遺伝子mPer2のノックアウトマウスにおいてリンパ腫が発生することが知られている。本研究課題では、哺乳類時計タンパクmPER2について、細胞内でどのような因子と複合体を形成しているのかを、複合体タンパク精製とそれに引き続く質量分析による解析で明らかにする。我々は、Tet-Offシステムを用いて薬剤依存性にflag-mPer2遺伝子の発現が制御できる安定細胞株を作成した。このTet-Off / flag-mPer2細胞株を大量培養し、得られた細胞抽出液をまずグリセロール濃度勾配遠心分離によって文画し、抗flag抗体を固定したアフィニティーカラムを用いてflag-mPER2を含むタンパク複合体を精製した。得られたタンパク複合体をSDS-PAGEにて展開し、タンパクを分離した。特異的なバンドを切り出し、トリプシンでゲル内消化したのち、MALDI-TOF MS/MS法にて質量分析を行った。その結果、いくつかのタンパクが同定されたが、そのうち細胞分裂などに関連する可能性のある一つのタンパクについて詳細な検討を加えた。得られたタンパクのcDNAを取得し、NIH3T3細胞にmPer2と共に一過性に発現させ、実際にこのタンパクとmPER2が細胞内で相互作用することを免疫沈降法で確認した。現在、このタンパクの概日リズムにおよぼす機能と、発がん制御につながる機能との両面から詳細に検討している。今後、mPer2以外の時計遺伝子についても同様に安定発現細胞株を樹立し、タンパク質複合体の解析を行っていく予定である。また、細胞レベルでの研究の他に個体レベルでmPER2発現と発がん制御との関連を解析するために、Tetシステムを利用した時間的な発現調節が可能な遺伝子導入マウスの作製を行っている。現在、遺伝子導入マウスが複数ライン取得できており、導入遺伝子の発現が適切に認められるかを検討している段階である。

This research topic is about the research of the control system. This research is based on a time-lapse analysis of mPer2. This research topic is about mammalian chronology, intracellular factor complex formation, complex purification, quality analysis, and analysis. We have developed stable cell lines for controlling the development of flag-mPer-2 genes by using Tet-Off-System. The Tet-Off / Flag-mPer2 cell line was cultured in large quantities, and the cell extract was obtained. The concentration of the extract was matched with the concentration of the extract. The anti-flag antibody was immobilized. The flag-mPer2 complex was purified. SDS-PAGE was used to develop and isolate the complex. The MALDI-TOF MS/MS method was used for quality analysis. The results of this study were discussed in detail. cDNA was obtained from NIH 3T3 cells, and the intracellular interaction between mPer2 and mPer2 was confirmed by immunoprecipitation Now, this is a general list of functions, control functions and detailed information. In the future, the timing of gene transfer in addition to mPer2 will be determined by the establishment of stable cell lines and the analysis of protein complexes. The analysis of the relationship between mPER2 discovery and control in the study of cell cycle and the regulation of mPER2 discovery and control in the study of cell cycle. Now, the introduction of the gene, the acquisition of the gene, the development of the gene, the identification of the gene.

项目成果

Hidehito Kimura: "Brain expression of apurinic/apyrimidinic endonuclease multifunctional DMA repair enzyme gene in the mouse with special reference to the suprachiasmatic nucleus"Neuroscience Research. 46. 443-452 (2003)

Hidehito Kimura：“无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶多功能 DMA 修复酶基因在小鼠中的脑表达，特别涉及视交叉上核”神经科学研究。

Shun Yamaguchi: "Synchronization of cellular clocks in the suprachiasmatic nucleus"Science. 302. 1277-1460 (2003)

Shun Yamaguchi：“视交叉上核细胞时钟的同步”科学。