概日リズム因子と発がん制御とのクロストークの研究

昼夜节律因素与癌变控制的串扰研究

基本信息

批准号：
16021237
负责人：
八木田和弘
金额：
$ 1.66万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16021237/
关键词：
概日リズム mPER2 リアルタイムモニター

项目摘要

本研究課題は、概日リズムと発がん制御とのクロストークの研究である。これまでの研究で、時計遺伝子mPer2のノックアウトマウスにおいてリンパ腫が発生することが知られている。本研究課題では、哺乳類時計タンパクmPER2について、細胞内でどのような因子と複合体を形成しているのかを、複合体タンパク精製とそれに引き続く質量分析による解析で明らかにする。我々は、Tet-Offシステムを用いて薬剤依存性にflag-mPer2遺伝子の発現が制御できる安定細胞株を作成した。このTet-Off/flag-mPer2細胞株を大量培養し、抗flag抗体を固定したアフィニティーカラムを用いてflag-mPER2を含むタンパク複合体を精製した。得られたタンパク複合体をSDS-PAGEにて展開し、タンパクを分離した。特異的なバンドを切り出し、トリプシンでゲル内消化したのち、MALDI-TOF MS/MS法にて質量分析を行った。その結果、いくつかのタンパクが同定されたが、このタンパクの概日リズムにおよぼす機能と、発がん制御につながる機能との両面から詳細に検討している。今後、mPer2以外の時計遺伝子についても同様に安定発現細胞株を樹立し、タンパク質複合体の解析を行っていく予定である。また、細胞レベルでの研究の他に個体レベルでmPER2発現と発がん制御との関連を解析するために、Tetシステムを利用した時間的な発現調節が可能な遺伝子導入マウスの作製を行っている。現在、遺伝子導入マウスが複数ライン取得できており、導入遺伝子の発現が適切に認められるかを検討している段階である。さらに、RNAiを用いた遺伝子ノックダウン法を培養細胞で確立し、その概日時計に及ぼす影響をルシフェラーゼを用いた生物発光によるリアルタイムモニター法にて測定する系を構築した。現在までに、時計遺伝子群についてRNAiを行い、培養細胞における概日時計の異常を観測した(投稿準備中)。この系を用いて、概日時計を構成する因子と発がん制御因子との分子ネットワークを解析している。

该研究主题是研究昼夜节律与致癌控制之间的串扰。先前的研究已经知道，淋巴瘤发生在敲除小鼠中，具有时钟基因MPER2。在本研究主题中，我们将通过复杂的蛋白质纯化以及随后通过质谱法分析哺乳动物钟蛋白MPER2细胞中的哪些因素和复合物形成。我们创建了一个稳定的细胞系，该细胞系能够使用TET-OFF系统以药物依赖性方式调节Flag-Mper2基因的表达。大量培养了此Tet-off/flag-mper2细胞系，并使用固定抗FLAG抗体的亲和力柱纯化含有flag-mper2的蛋白质复合物。使用SDS-PAGE开发了所得的蛋白质复合物以分离蛋白质。切除特定条带，用胰蛋白酶消化性糖内血症，然后使用MALDI-TOF MS/MS方法进行质谱。结果，已经鉴定出了几种蛋白质，并以该蛋白在昼夜节律中的功能和导致癌变控制的功能进行了详细的检查。将来，我们计划为MPER2以外的其他时钟基因建立稳定的表达细胞系，并分析蛋白质复合物。除了在细胞水平上进行研究外，我们还一直在创建转基因小鼠，可以使用TET系统在时间表达中调节，以分析MPER2表达与各个水平的致癌控制之间的关系。当前，可以获取多个线转染的小鼠，我们目前正在考虑是否适当观察到转基因表达。此外，建立了一个系统，其中在培养细胞中建立了使用RNAi的基因敲低方法，并使用基于实时的生物发光的监视器使用荧光素酶测量其影响对昼夜节律的影响。迄今为止，在时钟基因组上进行了RNAi，以观察培养细胞中昼夜节律时钟的异常（准备发布）。该系统用于分析构成昼夜节律调节剂的因素的分子网络。