光を用いたタンパク質結晶化法の開発

开发利用光的蛋白质结晶方法

基本信息

批准号：
15033213
负责人：
平塚浩士
金额：
$ 2.94万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

タンパク質の構造解析を行う上で、現在解決すべき課題は「タンパク質を結晶化し、質の良い結晶を作ること」である。解析技術が飛躍的に進歩した一方、結晶作成の分野では、それに匹敵する革新的な改良はまだない。タンパク質の結晶化には、決まった手法は存在せず、熟練と経験を積んだテクニシャンの技量により、成果が決定されている。タンパク質の種類に応じた沈殿剤の種類と濃度、緩衝溶液の種類と濃度、結晶化の温度、およびタンパク質の濃度、純度など、天文学的なパラメーターの中から適する組み合わせを選べだし、結晶化を進める必要がある。質の良い結晶を作るためには、さらに結晶化条件を厳選する必要がある。本研究では、弱い紫外線を短時間照射することにより、核形成が起こらない程度の低過飽和溶液(準安定状態)中に、結晶核が形成されることを明らかにし、その機構について検討した。その結果、・X線結晶構造解析によって、光照射により得られた結晶は、定法により得られた結晶と格子定数が同じである。・結晶化促進に効果がある光の波長はリゾチームの光吸収スペクトルと対応している。・150〜300Wのキセノンランプ光をリゾチームの過飽和溶液に30秒程度照射すると結晶化が促進されるが、長い時間照射すると結晶は出現しにくくなる。・核形成が促進される照射時間(30秒以内)では、酵素活性は低下しない。酵素活性の低下は2光子過程で起こる。・一光子吸収により生成した中間体が核形成促進に関与していると考えた。・リゾチーム以外のタンパク質として、ソーマチン(Thaumatin)を用い、やはり光照射により、核形成が促進されることを示した。

进行蛋白质结构分析时要解决的当前问题是“结晶蛋白质并产生高质量的晶体”。尽管分析技术已经取得了巨大的进步，但尚未有任何与晶体生产领域的领域相媲美的创新改进。没有固定的蛋白质结晶方法，结果由熟练和经验丰富的技术人员确定。有必要根据天文参数选择适当的组合，例如根据蛋白质类型的类型和浓度，缓冲液的类型和浓度，结晶的温度，蛋白质的浓度，纯度等以及结晶的进展。为了产生高质量的晶体，有必要仔细选择结晶条件。在这项研究中，我们揭示了晶体核是在低过饱和溶液（亚稳态）中形成的，该溶液（亚稳态）不会通过短辐射和弱紫外线来形成成核，并研究了该过程的机制。结果，通过X射线晶体结构分析获得的光照射获得的晶体具有与标准方法获得的晶体相同的晶格常数。 - 有效促进结晶的光的波长对应于溶菌酶的光吸收光谱。 - 用150-300W Xenon灯光辐照溶菌酶的过饱和溶液约30秒，将促进结晶，但是如果很长一段时间辐射，则不会出现晶体。 - 促进成核时的酶活性在辐照时不会降低。酶活性的降低发生在两光子过程中。 - 人们认为，单光子吸收产生的中间体涉及促进成核。 -thamatin（thaumatin）被用作溶菌酶以外的蛋白质，并表明成核是通过光照射促进的。