新たな乳がん幹細胞誘導因子としてのPRDM14の機能解析

PRDM14作为新型乳腺癌干细胞诱导剂的功能分析

• 批准号: 16K21519
• 负责人: 諏訪 喜昭
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kwansei Gakuin University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-01 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16K21519/
• 关键词: 転写制御; エピジェネティクス; 癌; 幹細胞; 構造生物学

本研究提案では、マウスの生殖系列・多能性幹細胞の成立・維持に必須の因子である転写制御因子PRDM14によるがんの悪性化、がん幹細胞形成・維持機構の解明を目的としている。がん細胞での解析を行う前に、まずマウスES細胞におけるPRDM14による多能性幹細胞の成立・維持の詳細を明らかとするため、マウスES細胞においてドキシサイクリン依存的にPrdm14の発現誘導を行い、PRDM14の標的遺伝子に対するエピジェネティックな修飾の変化の解析を行った。その結果、速やかなヒストンH3アセチルの減少およびH3K27のトリメチル化の増加が見られた。また同時に、CBFA2T2, HDAC1, CTBP2, SUZ12といったヒストン修飾に関わる因子のリクルートの促進が観察された。そこで、PRDM14による多能性の維持・獲得に対するPRC2複合体の関与を検証するため、PRDM14とPRC2複合体との相互作用を確認したところ、弱いながらもPRDM14とPRC2複合体の構成因子のひとつであるSUZ12との相互作用が観察された。同時に、CRISPR/Cas9によりSuz12をノックアウトした細胞を樹立し、PRDM14による転写制御の解析を行ったところ、興味深いことに一部の標的遺伝子において転写抑制のみならず転写活性化においても減弱が見られた。これらのことから、PRDM14はPRC2と複合体を形成し転写を制御することで多能性の獲得・維持に関わることが示唆された。一方で、PRDM14が形成する複合体の立体構造解析のため大腸菌を用いた発現系の構築を行った。完全長PRDM14では、発現量が低くまた、高純度精製が困難であったため最終的な収量が少なく構造解析に必要なタンパク質を得ることができなかった。そこで、PRドメインのみの発現系の構築・高純度精製を試み、高純度なタンパク質を得ることに成功した。

This study proposes that the reproductive series, establishment and maintenance of pluripotent stem cells require the development of regulatory factors PRDM14, and the development and maintenance of stem cells. Details of the establishment and maintenance of pluripotent stem cells in PRDM14 and ES cells before and after analysis of PRDM 14 and ES cell-dependent expression induction As a result, the decrease of H3 and the increase of H3 and K27 were observed. At the same time, CBFA2T2, HDAC1, CTBP2, SUZ12 and other related factors are detected. The interaction between PRDM14 and PRC2 complex was confirmed by the maintenance and acquisition of pluripotency in PRDM14 and the interaction between PRDM 14 and PRC2 complex. At the same time, CRISPR/Cas9 can be used for cell culture, PRDM14 can be used for cell control analysis, and a part of CRISPR/Cas9 can be used for cell culture inhibition and cell activation. PRDM14 is a complex of PRC2 and PRC3. The analysis of the three-dimensional structure of the complex formed by PRDM14 and the construction of the development system for Escherichia coli were carried out. Complete length PRDM14, low yield, high purity, difficulty, final yield, structural analysis, quality, etc. The construction, purification and quality of the product were successfully achieved.