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立体構造を基にした長鎖脂肪酸伸長酵素の触媒反応機構と基質特異性の決定要因の解明

基于三维结构阐明长链脂肪酸延伸酶催化反应机制及底物特异性决定因素

基本信息

批准号：
17K15442
负责人：
佐藤友美
金额：
$ 2.66万
依托单位：
High Energy Accelerator Research Organization
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-01 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、小胞体膜に存在する長鎖脂肪酸伸長酵素(ELOVLファミリータンパク質)の立体構造に基づいた触媒反応機構を明らかにすることを目的として研究を進めた。ELOVLファミリータンパク質は、糖尿病治療に関与する可能性が示唆される一方で、ホモログを含めて立体構造解析の成功例はなく、論理的な創薬の基盤となる構造情報が待ち望まれている。研究開始時点ではすでに、ヒトのELOVLと相同性を持つ複数の遺伝子をGFP融合タンパク質としてHEK細胞にて発現させ、GFP蛍光を指標としたFSECにてスクリーニングした結果、好熱性紅藻由来のホモログが構造解析に適していることを見出していた。そこで、本年度は、同遺伝子由来タンパク質の結晶化に適した大量発現精製系を構築するための条件検討を行った。コンストラクト・発現系・発現条件・精製法についての条件検討を行った結果、P. pastoris発現系にて発現させ、Niアフィニティークロマトグラフィーと陰イオン交換カラムにより精製することにより、1 L培養あたり約1 mgの精製標品を取得できる系の構築に成功した。ELOVLタンパク質はP. pastoris中で小胞体膜に局在しており、精製標品はゲル濾過分析にて単分散のピークを示した。そこで、所属機関に設置されている大規模結晶化装置を用いて、蒸気拡散法とLCP法にて約1000条件の結晶化の初期スクリーニングを行った。得られた結晶を用いてPFのBL17AにてX線回折実験を行ったが、回折点は得られなかった。

The purpose of this study is to improve the research on the existence of ELOVL elongation enzyme (Fatty Acid elongation enzyme) in the membrane of small cell membrane. ELOVL information about the treatment of diabetes, the possibility of diabetes treatment, and the possibility of diabetes treatment suggest that there is a problem of success in the analysis of three-dimensional information, and that there is a lot of information to be reported. At the beginning of the study, we analyzed the results of the complex data fusion test of ELOVL, the fusion of GFP, the detection of HEK cells, the analysis of the results of FSEC tests, the analysis of the origin of sexual algae, and the analysis of data. The reason for this year, this year and the same year is that the results show that a large number of conditions are in line with each other. This is the result of the excercise condition method, the condition precision method, the condition test result, the pastoris test result, the Ni test result, the success test, the success test, and the success test. In the pastoris of ELOVL, the microsomal membrane was analyzed by microsomal membrane analysis and dispersive analysis. The equipment, equipment, temperature, temperature, temperature The results show that you can use the PF BL17A X line to fold back the number of lines, and the return point to get the correct results.