立体構造を基にした長鎖脂肪酸伸長酵素の触媒反応機構と基質特異性の決定要因の解明

基于三维结构阐明长链脂肪酸延伸酶催化反应机制及底物特异性决定因素

基本信息

批准号：
17K15442
负责人：
佐藤友美
金额：
$ 2.66万
依托单位：
High Energy Accelerator Research Organization
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-01 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、小胞体膜に存在する長鎖脂肪酸伸長酵素(ELOVLファミリータンパク質)の立体構造に基づいた触媒反応機構を明らかにすることを目的として研究を進めた。ELOVLファミリータンパク質は、糖尿病治療に関与する可能性が示唆される一方で、ホモログを含めて立体構造解析の成功例はなく、論理的な創薬の基盤となる構造情報が待ち望まれている。研究開始時点ではすでに、ヒトのELOVLと相同性を持つ複数の遺伝子をGFP融合タンパク質としてHEK細胞にて発現させ、GFP蛍光を指標としたFSECにてスクリーニングした結果、好熱性紅藻由来のホモログが構造解析に適していることを見出していた。そこで、本年度は、同遺伝子由来タンパク質の結晶化に適した大量発現精製系を構築するための条件検討を行った。コンストラクト・発現系・発現条件・精製法についての条件検討を行った結果、P. pastoris発現系にて発現させ、Niアフィニティークロマトグラフィーと陰イオン交換カラムにより精製することにより、1 L培養あたり約1 mgの精製標品を取得できる系の構築に成功した。ELOVLタンパク質はP. pastoris中で小胞体膜に局在しており、精製標品はゲル濾過分析にて単分散のピークを示した。そこで、所属機関に設置されている大規模結晶化装置を用いて、蒸気拡散法とLCP法にて約1000条件の結晶化の初期スクリーニングを行った。得られた結晶を用いてPFのBL17AにてX線回折実験を行ったが、回折点は得られなかった。

这项研究的目的是阐明基于内质网膜中存在的长链脂肪酸伸长酶（Elovl家族蛋白）的三维结构的催化反应机制。虽然提出ELOVL家族蛋白可能参与糖尿病治疗，但没有成功的构象分析病例，包括同源物，以及构成逻辑药物发现基础的结构信息。在研究开始时，已经在HEK细胞中以GFP融合蛋白的形式表达了与人Elovl具有同源性的多个基因，并使用FSEC使用GFP荧光作为指标进行筛选，并发现源自嗜热红藻类的同源物是用于结构分析的。因此，研究了今年的条件，用于构建适合于同一基因衍生的蛋白质结晶的大规模表达纯化系统。通过对构建体，表达系统，表达条件和纯化方法进行研究的结果，该系统通过在P. p. p. pastoris表达系统中表达并使用Ni亲和色谱和阴离子交换柱进行纯化，从而成功地构建了该系统，可以获得大约每1 L培养的大约1 mg纯化的样品。 Elovl蛋白位于P. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. pertration Analysis中。因此，使用蒸气扩散法和LCP方法安装在附属机构上的大规模结晶装置，对大约1,000条条件进行结晶的初始筛选。使用获得的晶体，在PF BL17A上进行X射线衍射实验，但没有获得衍射点。