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立体構造を基にした長鎖脂肪酸伸長酵素の触媒反応機構と基質特異性の決定要因の解明

基于三维结构阐明长链脂肪酸延伸酶催化反应机制及底物特异性决定因素

基本信息

批准号：
17K15442
负责人：
佐藤友美
金额：
$ 2.66万
依托单位：
High Energy Accelerator Research Organization
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-01 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、小胞体膜に存在する長鎖脂肪酸伸長酵素(ELOVLファミリータンパク質)の立体構造に基づいた触媒反応機構を明らかにすることを目的として研究を進めた。ELOVLファミリータンパク質は、糖尿病治療に関与する可能性が示唆される一方で、ホモログを含めて立体構造解析の成功例はなく、論理的な創薬の基盤となる構造情報が待ち望まれている。研究開始時点ではすでに、ヒトのELOVLと相同性を持つ複数の遺伝子をGFP融合タンパク質としてHEK細胞にて発現させ、GFP蛍光を指標としたFSECにてスクリーニングした結果、好熱性紅藻由来のホモログが構造解析に適していることを見出していた。そこで、本年度は、同遺伝子由来タンパク質の結晶化に適した大量発現精製系を構築するための条件検討を行った。コンストラクト・発現系・発現条件・精製法についての条件検討を行った結果、P. pastoris発現系にて発現させ、Niアフィニティークロマトグラフィーと陰イオン交換カラムにより精製することにより、1 L培養あたり約1 mgの精製標品を取得できる系の構築に成功した。ELOVLタンパク質はP. pastoris中で小胞体膜に局在しており、精製標品はゲル濾過分析にて単分散のピークを示した。そこで、所属機関に設置されている大規模結晶化装置を用いて、蒸気拡散法とLCP法にて約1000条件の結晶化の初期スクリーニングを行った。得られた結晶を用いてPFのBL17AにてX線回折実験を行ったが、回折点は得られなかった。

The present study aims to further investigate the three-dimensional structure of a long-chain fatty acid elongating enzyme (ELOVL), which exists in cellular membranes, and its catalytic mechanism. ELOVL provides information on the nature of diabetes, the possibility of diabetes treatment, and the structural information of diabetes including successful examples of three-dimensional structural analysis, logical innovation, and the basis for diabetes treatment. At the beginning of the study, we found that the similarity of the two species was consistent with the existence of GFP fusion in HEK cells, the GFP fluorescence index in FSEC, and the structural analysis of the origin of thermophilic red algae. This year, the conditions for the construction of a large number of crystallization and purification systems for the same crystals were discussed. The results of the study of the conditions for the development of P. pastoris, the development of P. pastoris, the exchange of P. pastoris, the purification of P. pastoris, the cultivation of P. pastoris, the preparation of P. pastoris, the purification of P. pastoris, the preparation of P. pastoris, the purification of P. pastoris, the preparation of P. pastoris, the purification of P. pastoris, the preparation of P. pastoris, the purification of P. pastoris, the preparation of P. pastoris, the preparation of P. pastoris, the purification of P. pastoris, the preparation of P. pastoris, the ELOVL P. In pastoris, small cell membranes are present, and refined standards are present for filtration analysis. The initial stage of crystallization under the conditions of about 1000 ° C by evaporation and LCP method was studied. The X-ray reflection of PF 17A was obtained from the crystal.