ゲノムワイドなパラログ同時ノックアウトスクリーニング系の構築

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本研究では、哺乳類細胞での複数同時ゲノム編集に適したCas12aを用いて、ヒトゲノムに存在するパラログを同時にノックアウトするライブラリを作製し、既存の１遺伝子ごとのノックアウトでは検出できなかったパラログの新たな遺伝子機能を探索するツールを開発することを目的としている。本年度は、選定したパラログセットに対するガイドRNAをコードするオリゴDNA（17596種）を合成し、レンチウイルスベクターにクローニングした。これを用いてノックアウトHeLa細胞プールを作製し、志賀毒素を作用させ、耐性細胞を回収した後に次世代シークエンスによってノックアウトされている遺伝子を同定した。志賀毒素の作用経路に関連する既知の遺伝子（パラログを有するが機能が冗長でないもの）はほぼすべて検出されたことから、Cas12aによるノックアウトが期待通り働いていることが確認できた。また、これまでの知見から志賀毒素の細胞内逆行性輸送に関与することが想定されるものの、過去に行われたスクリーニングでは同定されなかったパラログについても今回検出することができた。さらに、レンチウイルスライブラリに含まれるガイドRNAの存在比とノックアウトHeLa細胞プール（志賀毒素未処理）のゲノムに含まれるガイドRNAの存在比を比較することで、細胞の生存・生育に必須のパラログの候補も得ることができた。この中に、同時にノックアウトして初めて必須となることが既に知られているパラログが含まれていた。以上のことから、パラログ同時ノックアウトという本研究のアプローチの有用性が支持された。