インフルエンザA型ウイルスノイラミニダーゼの高次構造形成に関する研究

甲型流感病毒神经氨酸酶高阶结构形成研究

• 批准号: 08760298
• 负责人: 西藤 岳彦
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08760298/
• 关键词: インフルエンザ; ノイラミニダーゼ; 立体構造; 糖鎖

インフルエンザA型ウイルスノイラミニダーゼ(NA)はホモ4量体のウイルス主要膜糖蛋白質であり、その高次構造形成にはアスパラギン結合型糖鎖が重要な役割を担っているとされている。本研究ではNA頭部領域に存在する3カ所の糖鎖結合部位(Asn84,144,398)に糖鎖が結合できない変異NAを作成し、糖鎖の欠失がNAの高次構造形成と機能に及ぼす影響について検討した。A/duck/Ukraine/63株由来のクローン化されたN8型NA遺伝子の、糖鎖結合配列(Asn-X-Thr/Ser)対応塩基に人工変異を導入し、3種の変異NA遺伝子、HG-1(Thr86→Asn)、HG-2(Asn144→Tyr)、HG-3(Ser400→Asn)を作成した。変異遺伝子は、ワクシニアウイルスWR株をベクターとしてMDCK細胞で発現させ、放射免疫沈降(RIP)を行った。また、各変異NAの酵素活性をFetuin、3'-N-acetylneuramin lactose(NAL)および6'-NALを基質として測定した。RIPの結果、HG-2 NAでは、野生型NAよりも低分子量の特異的バンドが検出され、正常な立体構造をもつNA単量体の存在が認められた。一方、HG-1、HG-3では、特異的なバンドは検出されなかった。酵素活性の測定では、HG-2のみが野生型NAと同様Fetuin,6'-NALに対する活性を示したが、野生型NAと比較してHG-2の6'-NALに対する活性は相対的に低下していた。。以上の結果から、Asn84およびAsn398糖鎖結合配列中のアミノ酸置換により、N8型NA頭部の高次構造形成が阻害されることが示された。一方、Asn144の置換による糖鎖の欠失は、高次構造形成には影響を及ぼさないことが、酵素の基質特異性に影響を与える可能性が示唆された。

The main membrane glycoproteins of the four molecules are mainly formed by the formation of high-order structures. In this study, there are three kinds of carbohydrate binding sites (Asn84,144,398) in the head region of NA, and the formation, function and influence of carbohydrate binding sites on the formation and function of higher-order structures of NA are discussed. A/duck/Ukraine/63 strain was transformed into N8-type NA gene, Asn-X-Thr/Ser gene, HG-1(Thr86→Asn), HG-2(Asn144→Tyr), HG-3(Ser400→Asn). The expression of CD34 + in MDCK cells and radioimmunosedimentation (RIP) were investigated. The enzyme activity of different NA was determined by Fetuin, 3'-N-acetylneuramin lactose(NAL) and 6'-NAL. RIP results, HG-2 NA, wild-type NA, low molecular weight, specific DNA, normal stereostructure, presence of NA units On one side, HG-1, HG-3, and special Namibian The enzyme activity of HG-2 was lower than that of wild-type NA and Fetuin, 6'-NAL. The above results show that Asn84 and Asn398 are resistant to acid substitution in the glyco-lock binding sequence, and the formation of higher-order structures in the head of N8-type NA is resistant to acid substitution. The effect of substitution of Asn144 on the formation of sugar chains and the possibility of enzyme substrate specificity are discussed.