変異ダイナミン導入細胞を用いたエンドサイトーシスの解析

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エンドサイトーシスに関与しているGTP結合蛋白質ダイナミンの機能を調べるために以下の実験を行った。1.2種類の変異ダイナミンを作成し、それぞれのGTP結合性を検定した結果、S45N変異はGDP結合型、T56F変異はGTP結合型であることを確認した。2.これらの変異ダイナミン遺伝子をHeLa細胞に導入し、安定発現株を得た。3.これらの細胞のエンドサイトーシス能を蛍光標識トランスフェリンを用いて形態学的に検討した結果、いずれの変異細胞でも著しいエンドサイトーシスの阻害が認められた。4.エンドサイトーシスの生化学的検討では、いずれの変異細胞でもアビジン非到達性が阻害されていた。5.このエンドサイトーシスの阻害が被覆小胞形成のどの段階で起こっているかを調べるため、電子顕微鏡を用いた検討を行った。1)まず、金標識抗トランスフェリン抗体で細胞表面レセプターを標識し、37°Cでエンドサイトーシスさせた。2)これらの細胞をルテニウムレッドで処理し、細胞表面と連続している膜構造を染色した。3)その結果、いずれの細胞でも金粒子はルテニウムレッド陽性の小胞状構造に留まっており、被覆小胞が形成される直前の段階で障害されていることが示唆された。6.細胞膜剥離観察法によるクラスリン被覆構造数を計測の結果、いずれの変異細胞でも被覆ピット数が野生型に比べ、20から50倍と著増していた。7.急速冷結・ディープエッチング法により、S45N細胞のクラスリン被覆ピットの頚部は細胞膜裏面の細胞骨格層を突き抜けて細胞質内に伸展していることが明らかになった。以上の結果より、ダイナミンはエンドサイトーシスにおけるクラスリン被覆小胞の形成に関与しており、そのGTP/GDP結合の異常により、被覆小胞膜のpinch-offに障害が起きることが明らかになった。今後はこれらの細胞を用いて、エンドサイトーシス障害が他の細胞機能に与える影響を検討していきたい。