がん細胞の浸潤転移を制御するダイナミンクロスブリッジ機構の解析

本研究は、がん細胞における仮足形成に必須であるアクチン及び微小管の再構成機構（ダイナミンクロスブリッジ）を明らかにする。本年度は、in vitro解析法を駆使してダイナミン２野生型、K562E、K562delta変異体によるアクチン線維束を電子顕微鏡にて観察し、クライオ電子顕微鏡による構造解析に向けた試料調製条件の最適化を試みた。ダイナミン２タンパクは、コムギ胚芽無細胞タンパク合成系を用いて調製した。アクチン線維束の観察は、負染色後、透過型電子顕微鏡を用いて行なった。ダイナミン２野生型により形成されたアクチン線維束は、１個あたり幅が約50nmで、K562E及びK562deltaにより形成されたアクチン線維束と同様であった。しかし、ダイナミン２野生型により形成されたアクチン線維束は、別の複数の線維束とともに、さらに束化していた。K562E及びK562delta変異体により形成されたアクチン線維束は、野生型のものと比べて顕著に再束化するアクチン線維が少なかった。そのため、ダイナミン２野生型を用いたアクチン線維束は、クライオ電子顕微鏡観察に不適であることが判明した。以降、K562EまたはK562delta変異体を用いたアクチン線維束を構造解析に使用することになった。また、クライオ電子顕微鏡観察する場合には、試料の濃度を高くする必要がある。しかしながら、ダイナミン２は、濃度の高い状態では、凝集しやすいため、条件のさらなる検討が必要になった。次年度には、分散したアクチン線維束の形成を高濃度に得る条件を探し出し、クライオ電子顕微鏡観察に備えたスクリーニングを行う予定である。

本研究は、がん細胞における仮足形成に必須であるアクチン及び微小管の再構成機構（ダイナミンクロスブリッジ）を明らかにする。本年度は、in vitro解析法を駆使してダイナミン２野生型、K562E、K562delta変異体によるアクチン線維束を電子顕微鏡にて観察し、クライオ電子顕微鏡による構造解析に向けた試料調製条件の最適化を試みた。ダイナミン２タンパクは、コムギ胚芽無細胞タンパク合成系を用いて調製した。アクチン線維束の観察は、負染色後、透過型電子顕微鏡を用いて行なった。ダイナミン２野生型により形成されたアクチン線維束は、１個あたり幅が約50nmで、K562E及びK562deltaにより形成されたアクチン線維束と同様であった。しかし、ダイナミン２野生型により形成されたアクチン線維束は、別の複数の線維束とともに、さらに束化していた。K562E及びK562delta変異体により形成されたアクチン線維束は、野生型のものと比べて顕著に再束化するアクチン線維が少なかった。そのため、ダイナミン２野生型を用いたアクチン線維束は、クライオ電子顕微鏡観察に不適であることが判明した。以降、K562EまたはK562delta変異体を用いたアクチン線維束を構造解析に使用することになった。また、クライオ電子顕微鏡観察する場合には、試料の濃度を高くする必要がある。しかしながら、ダイナミン２は、濃度の高い状態では、凝集しやすいため、条件のさらなる検討が必要になった。次年度には、分散したアクチン線維束の形成を高濃度に得る条件を探し出し、クライオ電子顕微鏡観察に備えたスクリーニングを行う予定である。