歯根膜細胞における力学的刺激感受性遺伝子のクローニング

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歯科矯正治療を目的とした便宜抜去歯に付着した歯根膜よりoutgrowth法を用いてヒト歯根膜細胞の培養を行った.次いで,これらの細胞をTrypsin-EDTAを用いてシャーレから剥がし,コラーゲンゲル中に包埋して三次元培養を行った.その後,ゲルを機械的にシャーレから剥がして細胞を張力から解放される刺激を加える群(release群)と,ゲルをそのままシャーレから剥がさず培養を続ける群(attatch群)の2群に分けた.ゲルrelease開始5分,10分,30分後にそれぞれlysis bufferを用いてcell lysateを調整し,リン酸化チロシンに対するモノクローナル抗体を用いたWestern blotを行った.すると,60kd付近と80kd付近のタンパクのリン酸化がrelease開始後5分,10分で時間依存的に上昇し,30分後には再びattatch群と同等レベルにまで減少することが分かった.これらの結果から,歯根膜細胞内のタンパクリン酸化に力学的刺激に呼応した変化が生じ,それらが力学的刺激情報伝達に関与している可能性が示唆された.さらに,我々はこのような力学的刺激によって歯根膜細胞における遺伝子発現にどのような変化を生じるのかを解析する目的で,刺激開始24時間後のrelease群の細胞,およびattatch群の細胞よりそれぞれFast-track kitを用いてmRNAの抽出行った.現在これらの試料より逆転写酵素を用いてcDNAを作成し,RNAmap kitを用いたdifferential display法を行い,変化の見られるバンドについてはそれらの特異性のならびに同定を行っている.