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血管内皮細胞ADPaseの構造とヌクレオチドレセプターとしての機能解析

血管内皮细胞ADPase核苷酸受体的结构和功能分析

基本信息

批准号：
08877329
负责人：
八木清仁
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08877329/
关键词：
ADPase Apyrase Ecto-apyrase 血管内皮細胞プリノセプター

项目摘要

ASPaseは血小板凝集惹起物質であるADPを分解し血管の抗血栓性作用に寄与していると考えられてきた。しかし申請者らの検討により本酵素が細胞外ヌクレオチドの情報を細胞内に伝える情報伝達系の一員として機能していることが示唆された。本申請研究において構造および機能を解析し、本酵素がヌクレオチドレセプター等の情報伝達系の一員であることを証明することを試みた。遺伝子構造解析および機能解析を用いることを目的として抗ADPaseモノクローナル抗体の作成を試みた。ウシ大動脈血管壁のミクロソーム画分を調製し、Triton X-100を用いてADPaseを可溶化後、DEAE Sepharose CL6Bカラムを用いて部分精製を行った。この画分を抗原としてマウスを免疫しその脾細胞とミエローマ細胞の細胞融合を行った。ハイブリドーマの培養上清を96穴ELISAプレートに吸着させ抗原として用いたADPase画分を添加し、抗ADPase抗体に吸着させ、洗浄した後にADPase活性を測定した。本スクリーニングにより6株のクローンが得られた。今後これらのモノクローナル抗体を用いて血管内皮細胞のcDNAライブラリーよりADPase遺伝子を単離する予定である。機能解析として血管内皮細胞のヌクレオチドによる細胞内Caイオン濃度上昇におけるADPaseの関与に関する検討を行った。P2YおよびP2Uプリノセプターのアゴニストであり非代謝性のAPPNP,ATPγSによるCaイオン濃度上昇はADPaseの阻害剤であるアジ化ナトリウムにより阻害を受けず、ADPによるCaイオン濃度上昇はアジ化ナトリウムにより著しく阻害された。したがってADPaseがヌクレオチドによる情報伝達系の一員であることが強く示唆された。今後はモノクローナル抗体を用いてより詳細な検討をする予定である。

ASPase-induced platelet aggregation is responsible for the antithrombotic effect of ADP on blood vessels. This enzyme is a member of the extracellular information system and a member of the intracellular information system. This application studies the structure and function of the enzyme, and proves that the enzyme is a member of the information system. The structure analysis and function analysis of the gene are used to test the production of anti-ADRP antibodies. The blood vessel wall of the artery was prepared by dissolving ADASE with Triton X-100 and refining it with DEAE Sepharose CL6 B. The cell fusion process 96-hole ELISA assay of ADase activity in culture supernatant by addition of anti-ADase antibody This is the first time that we've seen this. In the future, the use of antibodies against vascular endothelial cells will be determined. Functional analysis of vascular endothelial cells in response to elevated intracellular Ca 2 + concentrations and related ADPs P2Y A member of the information transmission system. In the future, the use of anti-inflammatory drugs will be discussed in detail.