血管内皮細胞ADPaseの構造とヌクレオチドレセプターとしての機能解析

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ASPaseは血小板凝集惹起物質であるADPを分解し血管の抗血栓性作用に寄与していると考えられてきた。しかし申請者らの検討により本酵素が細胞外ヌクレオチドの情報を細胞内に伝える情報伝達系の一員として機能していることが示唆された。本申請研究において構造および機能を解析し、本酵素がヌクレオチドレセプター等の情報伝達系の一員であることを証明することを試みた。遺伝子構造解析および機能解析を用いることを目的として抗ADPaseモノクローナル抗体の作成を試みた。ウシ大動脈血管壁のミクロソーム画分を調製し、Triton X-100を用いてADPaseを可溶化後、DEAE Sepharose CL6Bカラムを用いて部分精製を行った。この画分を抗原としてマウスを免疫しその脾細胞とミエローマ細胞の細胞融合を行った。ハイブリドーマの培養上清を96穴ELISAプレートに吸着させ抗原として用いたADPase画分を添加し、抗ADPase抗体に吸着させ、洗浄した後にADPase活性を測定した。本スクリーニングにより6株のクローンが得られた。今後これらのモノクローナル抗体を用いて血管内皮細胞のcDNAライブラリーよりADPase遺伝子を単離する予定である。機能解析として血管内皮細胞のヌクレオチドによる細胞内Caイオン濃度上昇におけるADPaseの関与に関する検討を行った。P2YおよびP2Uプリノセプターのアゴニストであり非代謝性のAPPNP,ATPγSによるCaイオン濃度上昇はADPaseの阻害剤であるアジ化ナトリウムにより阻害を受けず、ADPによるCaイオン濃度上昇はアジ化ナトリウムにより著しく阻害された。したがってADPaseがヌクレオチドによる情報伝達系の一員であることが強く示唆された。今後はモノクローナル抗体を用いてより詳細な検討をする予定である。