内耳・脳幹の神経系情報伝達に関するホスホリパーゼCについての組織化学的研究

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【研究目的】 外有毛細胞の細胞膜で神経伝達の中心として機能しているのはホスホリパーゼCであることが知られている。しかしこれが内・外有毛細胞の機能分化にどのように関与しているかは確認されていない。このホスホリパーゼCにはアイソザイムグループとしてβ、γ、δの3つが存在する。近年さらにβ1〜4、γ1、2、δ1、2と合計8種類が分類され、それぞれ特異抗体によりホスホリパーゼCの可視化が可能になってきた。本研究の目的はこれらの特異抗体を用いて1)成熟モルモットの蝸牛有毛細胞及び球形嚢、卵形嚢、三半規管、さらに脳幹の蝸牛神経核においてホスホリパーゼCの局在を検討する。2)胎生後期から生後2、3週頃までの発生段階におけるホスホリパーゼCアイソザイムの発現を明らかにし内耳-脳幹における意義を検討することにある。【研究実績】 これまでホスホリパーゼCが豊富に存在することが報告されている脳を試料として用い、200倍と1000倍の高濃度の1次抗体をホルマリン系の固定液であるホルマリン、チンクホルマリンさらにアルコール系の固定液であるカルノア液と組合せ通常のDAB反応を行った。その結果β1は4%ホルマリンとチンクホルマリンを用いると染色性が高いが、カルノア液を用いると全く染色されなかった。同様にβ3とγ2はチンクホルマリンでのみ染色され他は無染色であった。β2、4、γ1、δ2はこれまで文献に記載されているサポニンやペプシン処理を組み合わせ染色性を高める条件を模索中である。最適な固定条件が決定すれば内耳や脳幹で行う予定である。現在β1、3とγ2に関してはチンクホルマリンで固定した生後0日目から36ヶ月目までの動物試料を作成中である。