染色体位置情報を利用した直接的有用遺伝子単離法の開発

利用染色体位置信息开发直接有用基因分离方法

• 批准号: 09876002
• 负责人: 荻原 保成
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Yokohama City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09876002/
• 关键词: AFLP100法; 遺伝子発現; マップベースクローニング; コムギ; フィンガープリンティング; 染色体部分欠乏系統; ノーザンブロット; サザンブロット解析; AMF法; PCR; CPNA; 穂の形態形成; 染色体部分欠失系統; 遺伝地図; 形質転換

コムギにおける染色体位置情報に基づいた直接的遺伝子単離法の確立のため、(1)コムギの穂の形態を制御するQ遺伝子、(2)T.timophceviの細胞質雄性不稔を回復するRf3遺伝子、(3)Aegilops crassaの日長感応性細胞質雄性不稔を回復するRfd1遺伝子をそれぞれコムギ染色体上、5AL,1BS,7BLにRFLPマーカーを用いて詳細にマッピングした。QとRfd1遺伝子にターゲットを絞った。Q遺伝子は5AL上、Xcdo1168から4.8cM,Xpsr370から4.1cMの位置にマッピングした。マッピングした遺伝地図と染色体部分欠失系統を用いた細胞学的地図を共通したDNAマーカーで構築し、両者を対応付け、コムギ染色体上でのDNAマーカーの座乗領域を明らかにした。さらに、Q遺伝子が欠失している5ALに関する染色体部分欠失系統q5と正常系統の穂の原基が形成される幼穂から全RNAを抽出した。Poly(A)^+RNAを抽出し、2重鎖cDNAを合成した。cDNAをTaqIで消化し、アダプターを連結し、PCRにより正常系統特異的mRNAを選抜した(Amplified Fragment Length Polymorphism(AFLP)-based mRNA Fingerprinting)。正常系統特異的cDNAをプラスミドベクターにクローニングした。都合、84種類の正常系統特異的クローンかえられた。これらのクローンのノーザンプロット解析により組織特異的発現を確認した結果、候補クローンを26に絞り込んだ。さらに、これらのクローンを(1)DNAシークエンスを決定した、(2)サザンハイブリダイゼーションにより、マッピングした結果、Q遺伝子と組み換え価0のものを2クローン選抜した。これらのクローンをコムギに形質転換し、目的遺伝子であることを確かめたい。同様にして、Rfd1遺伝子の候補クローン22をえた。これらのクローンを特徴つけ目的の遺伝子をクローニングしたい。

コ ム ギ に お け る chromosome location intelligence に base づ い た direct heritage 伝 son 単 の from method to establish の た め, (1) コ ム ギ の meet の form を suppression す る Q heritage 伝 child, (2) the T.t imophcevi の cytoplasmic male not mori を reply す る Rf3 伝, (3) Aegilops Crassa の day long feeling 応 sex cytoplasmic male not mori を reply す る Rfd1 posthumous son 伝 を そ れ ぞ れ コ ム ギ chromosome, 5 al, 1 bs, 7 bl に RFLP マ ー カ ー を with い て detailed に マ ッ ピ ン グ し た. QとRfd1 remains 伝 seed にタ と ゲットを ゲットを twisted った. Q heritage 伝 は 5 on al, Xcdo1168 か ら 4.8 cM, Xpsr370 か ら position 4.1 cM の に マ ッ ピ ン グ し た. マ ッ ピ ン グ し た heritage 伝 to 図 と chromosome part owe を loss system with い た cytology of 図 を common し た DNA マ ー カ ー で build し, struck を 応 pay け, seaborne コ ム ギ chromosome で の DNA マ ー カ ー の seat 乗 field を Ming ら か に し た. さ ら に, Q heritage 伝 が owe son lost し て い る 5 al に masato す る chromosome lost part of owe system q5 と normal system の meet の primordium が form さ れ る young meet か ら all RNA を drew し た. Poly(A)^+RNAを is extracted from を and 2-relocked cDNAを is synthesized into た た. cDNAをTaqIで digestion <s:1>, アダプタ アダプタ を を linkage <e:1>, PCRによ <s:1> normal system-specific mRNAを selection た(Amplified Fragment Length Polymorphism(AFLP)-based mRNA Fingerprinting). The cDNA specific to the normal system is をプラス をプラス ドベ タ <s:1> タ タ に ロ ニ ニ グ グ た た た. All of the 84 types are specific to the normal system of the class ロ ロ えられた えられた えられた えられた えられた えられた えられた えられた えられた. こ れ ら の ク ロ ー ン の ノ ー ザ ン プ ロ ッ ト parsing に よ り tissue specific 発 を now confirmed し た results, alternate ク ロ ー ン を 26 に ground り 込 ん だ. さ ら に, こ れ ら の ク ロ ー ン を (1) DNA シ ー ク エ ン ス を decided し た, (2) サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に よ り, マ ッ ピ ン グ し た results, Q but 伝 と group み in え 価 0 の も の を 2 ク ロ ー ン choose sorting し た. The form and substance of をコムギに are replaced by 転, the target remains are 伝, the である are とを, the とを are confirmed by めた めた. The same as に て, Rfd1 remains 伝, alternate, ロ, <s:1>, 22をえた. こ れ ら の ク ロ ー ン を, 徴 つ け purpose の heritage 伝 son を ク ロ ー ニ ン グ し た い.

项目成果

Kojima,T.et al.: "High-resalution RFLP mapping of the fertibity restoration(Rf3)gene against Tritium timophersi aptoplasm located on chremosome IBS of comrnnwhent" Genes and Genetic Systems. 72. 353-359 (1997)

Kojima,T.等人：“针对位于共生染色体 IBS 上的氚提莫弗氏细胞凋亡质的生育力恢复 (Rf3) 基因的高分辨率 RFLP 定位”基因和遗传系统。

Kojima T and Y.Ogihara: "High-resolution RFLP map of the lurgarm of chromosome SA in wheats and its synteny among areals" Genes and Gavetic Systems. 73. 51-58 (1998)

Kojima T 和 Y.Ogihara：“小麦 SA 染色体 lurgarm 的高分辨率 RFLP 图及其区域之间的同线性”基因和 Gavetic 系统。

Kajima,T.,T.Nagaoka,KNoda and Y.Ogihara: "Gevetic linkage map of ISSR and RAPD markers in Einkornwhait in relation to that of RFLP markers" Theorerical and Applied Gevetics. 96. 37-45 (1998)

Kajima,T.,T.Nagaoka,KNoda 和 Y.Ogihara：“单粒小麦中 ISSR 和 RAPD 标记的 Gvetic 连锁图与 RFLP 标记的关系”理论和应用 Gevetics。

Ogihara Y.et al.: "Clorning of cDNA specifically expressed in whert spikelets as the heading stage,as identified by the simple differentical display method" Plant Science. (in press). (1998)

Ogihara Y.等人：“克隆在抽穗期的小穗中特异性表达的 cDNA，通过简单的差异显示方法进行鉴定”《植物科学》。

Kojima,T.H.Tsujimoto & Y.Ogihara: "High-resolution RFLP mapping of the funtility restorection (RF3)gene against Tritiun tiwopheeri applism located on chromosome IBS ofemumnuhos" Genes cvel Genetic Systems. 72. 353-359 (1997)

小岛,T.H.辻本