遺伝子ターゲッティングの組換え頻度を調節する分子同定の試み:次世代の遺伝子治療への基礎的アプローチ

尝试识别基因靶向中调节重组频率的分子：下一代基因治疗的基本方法

• 批准号: 09878152
• 负责人: 園田 英一朗
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09878152/
• 关键词: Rad51; DNA修復; 相同組換え; 誘導型ノックアウト; DT40細胞; 染色体異常

出芽酵母においてRad51蛋白はRad52変異群に属し、遺伝子組み換えやDNA2重鎖切断の修復に働いていることが知られており、高等真核細胞でも同様な機能を担っていると考えられているが、その表現型は致死となるため十分な解析はできていない。今回、我々はテトラサイクリン抑制型プロモーター(Tet-off)システムを用い、Rad51-/-細胞株を単離し、Rad51蛋白の欠失が細胞増殖・分裂及び染色体の安定性に及ぼす影響を詳細に解析した。【方法】高頻度相同組み換えを示す鶏DT40細胞株を用い、まず片方の鶏Rad51遺伝子座をノックアウトした。次にテトラサイクリンにより抑制される活性化因子とヒトRad51(ヒトRad51)cDNAを導入し、ヒトRad51蛋白発現下に、第2の鶏Rad51遺伝子座のノックアウトをおこない、鶏Rad51-/-DT40細胞を得た。【結果】1)Rad51-/-DT40は、ヒトRad51蛋白発現下に野生株とほぼ同様の増殖分裂を示した。2)テトラサイクリン添加にて、細胞内HsRad51蛋白量は徐々に低下し、12時間後にはウエスタンブロットにて検出不可能となった。それに伴い12時間後より、すべての細胞が、G2/M集積しはじめ36時間後にはすべての細胞が死亡した。細胞がG2/Mに集積している18時間後に、コルセミド添加にて核型を分析すると多くの染色体断裂像が見られた。【考察】Rad51蛋白が高等真核細胞の増殖において必須であることが、はじめて明瞭に示された。Rad51蛋白の欠失により細胞同期がG2/Mでとまり、また多くの染色体断裂が出現して細胞が死亡する。このことは、Rad51蛋白が放射線などの外的要因によるDNA2重鎖切断のみならず、正常のDNA複製過程においても、DNA2重鎖切断修復を介して、染色体全体の安定性を保持していることが強く示唆された。

Rad51 protein in budding yeast belongs to the Rad52 heterogroup, and its sub-group changes and DNA2 double lock breaks and repairs. It has the same function in higher eukaryotes. In this paper, we analyze in detail the effects of Rad51-/-cell line isolation, Rad 51 protein deficiency on cell proliferation, division, and chromosome stability. [Methods] The high frequency of cell transformation in the same group was shown in DT40 cell line and Rad51 gene locus in the same group. Next, the cDNA of Rad51(Rad51) was introduced into the cell, the Rad51 protein was developed, the second Rad 51 gene locus was developed, and Rad51-/-DT40 cells were obtained. [Results] 1)Rad51-/-DT40 protein expression was detected in wild plants and in the same species. 2) The amount of HsRad51 protein in cells decreased gradually after 12 hours. After 12 hours, the cells were killed, and after 36 hours, the cells were killed. After 18 hours of accumulation of G2/M cells, multiple chromosome breaks were observed. [Investigation] Rad51 protein is necessary for the growth of higher eukaryotes. Loss of Rad51 protein results in cell death due to multiple chromosome breaks and G2/M synchronizations. Rad51 protein is an important factor in radiation, DNA2 double-lock cleavage, normal DNA replication, DNA2 double-lock cleavage repair, and maintenance of chromosome stability.

项目成果

Sonoda E. et al.: "Rad51-deficient vertebrate cells accumulate chromosomal breaks prior to cell death." EMBO J.17・2. 598-608 (1998)

Sonoda E. 等人：“Rad51 缺陷的脊椎动物细胞在细胞死亡之前积累染色体断裂。” EMBO J.17・2 (1998)。