放射性同位元素標識プラスミドを用いた低線量内部被ばく影響の数値化

ヒト色素性乾皮症皮膚線維芽細胞HTZ17XP（ATCC CRL-1360、以下XP）またはヒト正常皮膚線維芽細胞NHDF（PromoCell C-12300、以下ND）を培養し、RNAを抽出してリアルタイムRT-PCRを行い、安定的に発現しているハウスキーピング遺伝子を検出するためのプライマーセット15種類の中から、細胞種の違いや培養時間の違い、プラスミドDNAのトランスフェクションの有無による影響をあまり受けず変動の少ないものを選別した。プラスミドDNAにレポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子を挿入したもの（pCMV-script-Luc）を使用して、XPおよび NDへの導入効率をルシフェラーゼアッセイによって測定した。放射性同位元素で標識されたDNAを添加してからトランスフェクションまでの手順をできるだけ少なくすることによって、添加したＲＩの損失が少なく、なおかつ核へのDNA導入効率が良い実験系を構築することを目的とした。その方法として、(1)セルフライゲーションの過程を除いて、直鎖状DNAのままトランスフェクションをする、(2)導入される培養細胞を、前培養されてプレートへ接着した状態ではなく、浮遊したままの状態でトランスフェクションを行う、など、様々な方法を試みた。ＲＩ標識反応として、PCR時にＲＩを添加するのではなく、すでに増幅の済んだPCR産物を基質として、従来からあるランダムプライマー標識法により標識する方法を検討した。32P-dCTPを用いて、精製カラムによる未反応ＲＩの除去・トランスフェクション・RNA抽出・リアルタイムRT-PCRの各行程において、反応チューブやカラムのそれぞれを測定し、どのようにＲＩが分配されていくかを検討した。

ヒト色素性乾皮症皮膚線維芽細胞HTZ17XP（ATCC CRL-1360、以下XP）またはヒト正常皮膚線維芽細胞NHDF（PromoCell C-12300、以下ND）を培養し、RNAを抽出してリアルタイムRT-PCRを行い、安定的に発現しているハウスキーピング遺伝子を検出するためのプライマーセット15種類の中から、細胞種の違いや培養時間の違い、プラスミドDNAのトランスフェクションの有無による影響をあまり受けず変動の少ないものを選別した。プラスミドDNAにレポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子を挿入したもの（pCMV-script-Luc）を使用して、XPおよび NDへの導入効率をルシフェラーゼアッセイによって測定した。放射性同位元素で標識されたDNAを添加してからトランスフェクションまでの手順をできるだけ少なくすることによって、添加したＲＩの損失が少なく、なおかつ核へのDNA導入効率が良い実験系を構築することを目的とした。その方法として、(1)セルフライゲーションの過程を除いて、直鎖状DNAのままトランスフェクションをする、(2)導入される培養細胞を、前培養されてプレートへ接着した状態ではなく、浮遊したままの状態でトランスフェクションを行う、など、様々な方法を試みた。ＲＩ標識反応として、PCR時にＲＩを添加するのではなく、すでに増幅の済んだPCR産物を基質として、従来からあるランダムプライマー標識法により標識する方法を検討した。32P-dCTPを用いて、精製カラムによる未反応ＲＩの除去・トランスフェクション・RNA抽出・リアルタイムRT-PCRの各行程において、反応チューブやカラムのそれぞれを測定し、どのようにＲＩが分配されていくかを検討した。