染色体複製起点へのヘリカーゼ導入機構：開始複合体の機能構造とその分子動態の解明

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染色体DNA複製は染色体上の複製起点領域から両方向に開始される。この基本的な原理がどのような分子機構によって支えられているのかは未だ解明されていない。その原因としては開始因子DnaAを主とする複製開始複合体が高次で動的な動態をもつため分子メカニズムの解析が困難であったことが大きい。しかしながら大腸菌では近年、染色体複製起点領域に形成される複製開始複合体の高次構造解明が大きく進歩したことで、複製開始複合体が機能の異なる左側と右側の二つのサブ複合体から構成されることが明らかになった。また、左側複合体が複製起点の二重鎖DNAを一本鎖化する分子機構までが解明された。本研究では、この新たな進展を大いに活用して、複製開始複合体が一本鎖化したDNA部位へと複製ヘリカーゼを両方向に装着するまでの分子動態を解析する。2年計画の初年度である2022年度においては、まず左側・右側DnaAサブ複合体のそれぞれと複製ヘリカーゼとの相互作用を解析するため多様な変異oriCプラスミドなどを構築した。これらを多様な変異DnaAタンパク質や複製ヘリカーゼタンパク質と試験管内で組み合わせ、DnaAのプロトマーレベルで生化学的に複製ヘリカーゼ装着活性を解析した。また、これらの結果は染色体oriCに同様の変異をもつ大腸菌変異株を用いた遺伝学的解析によっても検証した。さらに、左側・右側DnaAサブ複合体が互いに相互作用するかについても生化学的に検証した。