カルシウム依存性発光蛋白アクアリンの分子構造の解析とカルシウム定量への応用

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本研究はカルシウムイオンの存在下に発光する蛋白質アクアリンの構造と機能を、遺伝子工学の手法を用いて明らかにしようとするものである。我々はアクアリンを産生するクラゲAequoria victoriaを米国シアトル効外のフライデーハーバー島で採集し、そのmRNAよりcDNAを合成し、大腸菌にクローニングしてcDNAライブラリーを作成した。このライブラリーよりオリゴヌクレオチドプローブを用いてアクアリンcDNAクローンを分離した。その塩基配列を決定したところ、アクアリンは189アミノ酸からなり、N末端には11個のリーダーペプチドが存在すること、カルシウムイオンが結合すると思われるEFハンド構造が3ヶ所に見い出されたこと、糖鎖が結合する配列は存在しないことが明らかになった。EFハンド構造はカルモジュリンなどのものと類似しており、進化的にはカルモジュリンなど他のカルシウム結合蛋白と同一の起源と考えられた。また蛋白質の各部分について親水性、疎水性を調べたところ、疎水性の大きなポケットが存在することが示唆され、ここが補助因子セレンテラジンとの相互作用の部位であると推定される。次にこれらの推定をより確かなものとするため、及び大量の純化アクアリンを得るために大腸菌の発現ベクターpUC9にcDNAを導入し、lacオペレーターの支配下にアクアリンのアポ蛋白の生合成を行った。抽出液にカルシウムイオン、メルカプトエタノール、補助因子セレンテラジンを加えたところ、エクオリン特有の発光反応を認めた。この系を用いてアクアリンの生産および構造と機能の関係を明らかにすることが可能となった。