カルシウム依存性発光蛋白アクアリンの分子構造の解析とカルシウム定量への応用

钙依赖性光蛋白aquarin的分子结构分析及其在钙定量中的应用

• 批准号: 60223023
• 负责人: 榊 佳之
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Special Project Research
• 财政年份: 1985
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1985 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-60223023/
• 关键词: カルシウムイオン; 発光タンパク質; アクアリン; cDNA; 発現ベクター

本研究はカルシウムイオンの存在下に発光する蛋白質アクアリンの構造と機能を、遺伝子工学の手法を用いて明らかにしようとするものである。我々はアクアリンを産生するクラゲAequoria victoriaを米国シアトル効外のフライデーハーバー島で採集し、そのmRNAよりcDNAを合成し、大腸菌にクローニングしてcDNAライブラリーを作成した。このライブラリーよりオリゴヌクレオチドプローブを用いてアクアリンcDNAクローンを分離した。その塩基配列を決定したところ、アクアリンは189アミノ酸からなり、N末端には11個のリーダーペプチドが存在すること、カルシウムイオンが結合すると思われるEFハンド構造が3ヶ所に見い出されたこと、糖鎖が結合する配列は存在しないことが明らかになった。EFハンド構造はカルモジュリンなどのものと類似しており、進化的にはカルモジュリンなど他のカルシウム結合蛋白と同一の起源と考えられた。また蛋白質の各部分について親水性、疎水性を調べたところ、疎水性の大きなポケットが存在することが示唆され、ここが補助因子セレンテラジンとの相互作用の部位であると推定される。次にこれらの推定をより確かなものとするため、及び大量の純化アクアリンを得るために大腸菌の発現ベクターpUC9にcDNAを導入し、lacオペレーターの支配下にアクアリンのアポ蛋白の生合成を行った。抽出液にカルシウムイオン、メルカプトエタノール、補助因子セレンテラジンを加えたところ、エクオリン特有の発光反応を認めた。この系を用いてアクアリンの生産および構造と機能の関係を明らかにすることが可能となった。

This study は カ ル シ ウ ム イ オ ン の presence に 発 light す る protein ア ク ア リ ン を と の structure function, but 伝 engineering の gimmick を with い て Ming ら か に し よ う と す る も の で あ る. I 々 は ア ク ア リ ン を produce す る ク ラ ゲ Aequoria Victoria を U.S. シ ア ト ル working outside の フ ラ イ デ ー ハ ー バ ー island で acquisition し, そ の mRNA よ り cDNA を synthetic し, coliform に ク ロ ー ニ ン グ し て cDNA ラ イ ブ ラ リ ー を made し た. こ の ラ イ ブ ラ リ ー よ り オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド プ ロ ー ブ を with い て ア ク ア リ ン cDNA ク ロ ー ン を separation し た. そ の salt base with column を decided し た と こ ろ, ア ク ア リ ン は 189 ア ミ ノ acid か ら な り, N terminal に は 11 の リ ー ダ ー ペ プ チ ド が exist す る こ と, カ ル シ ウ ム イ オ ン が combining す る と think わ れ る EF ハ ン ド structural が ヶ に see い out さ れ た こ と, sugar lock が combining す る match column は exist し な い こ と が Ming ら か に な Youdaoplaceholder0. EF ハ ン ド tectonic は カ ル モ ジ ュ リ ン な ど の も の と similar し て お り, evolution of に は カ ル モ ジ ュ リ ン な ど he の カ ル シ ウ ム binding protein と same origin と の exam え ら れ た. ま た protein の parts に つ い て hydrophilic, waterborne を 疎 べ た と こ ろ, big 疎 water-based の き な ポ ケ ッ ト が exist す る こ と が in stopping さ れ, こ こ が subsidy factor セ レ ン テ ラ ジ ン と の interaction の parts で あ る と presumption さ れ る. Time に こ れ ら の presumption を よ り か indeed な も の と す る た め and び large の purification ア ク ア リ ン を must る た め に coliform の 発 now ベ ク タ ー pUC9 に cDNA を import し, lac オ ペ レ ー タ ー の domination に ア ク ア リ ン の ア の ポ protein biosynthesis を line っ た. Extract に カ ル シ ウ ム イ オ ン, メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル, accessorial factor セ レ ン テ ラ ジ ン を plus え た と こ ろ, エ ク オ リ ン の unique 発 light anti 応 を recognize め た. こ の is を with い て ア ク ア リ ン の production お よ び function of tectonic と の masato を and Ming ら か に す る こ と が may と な っ た.

项目成果

Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.82-5. (1985)

美国国家科学院院刊 82-5。