大腸菌テトラサイクリン排出系のエネルギー共役機構

細菌のテトラサイクリン(TC)耐性は、能動的排出によるという点できわめて特異な耐性である。本研究は、TC輸送の分子機構を明らかにすることを目的としている。既に前年度において、TCはH^+との1:1の逆輸送であり、電気的には中性な、主としてpH勾配により駆動される輸送系であることを明らかにした。しかし、TC分子は整理的環境下ではTH_2またはTHという中性または陰イオン型として存在することが知られており、もしH^+との逆輸送系であれば、その輸送過程は電気的に中性ではなく、少なくとも2個の正味の電荷の移動を伴う筈であり、観察された事実と矛盾する。我々は、第3のイオンが共輸送されている可能性を検討した。TC輸送系の活性にはMg^<2+>が必須であり、Co^<2+>は更に効率よくTC輸送を活性化するが、Cd^<2+> Mn^<2+> Zn^<2+>などは無効である。そこで60Co^<2+>の輸送を測定した所、TC耐性蛋白TetAに仲介されて、TCの輸送と共役したCoの輸送が認められた。Mg^<2+>またはCo^<2+>存在下では、TCは中性付近の溶媒中で、THMg^<+>またはTHCo^<+>という一価カチオンとして存在することが知られている。TetAにより輸送される分子が一価カチオンであればH<+>との交換により電気的中性となり、エネルギ-共役実験の結果と一致する。次に、THMg+とH+の技薬輸送の素過程を明らかにするため、基質結合部位またはエネルギ-共役部位に欠損を持つTetA蛋白を産生する変異株の単離を試みた。いくつかのTC耐性遺伝子の共通配列からTC結合部位と予想されている領域の近傍にあるEcoRVサイト付近に約100bp欠失を導入したところ、TetA蛋白が産生されているにもかかわらずTC感受性となる菌株が得られた。次年度においては、この変異株の性質を調べるとともに、更にエネルギ-共役部位と考えられているC末側ドメインに欠失を持った変異株を調製する。

細菌のテトラサイクリン(TC)耐性は、能動的排出によるという点できわめて特異な耐性である。本研究は、TC輸送の分子機構を明らかにすることを目的としている。既に前年度において、TCはH^+との1:1の逆輸送であり、電気的には中性な、主としてpH勾配により駆動される輸送系であることを明らかにした。しかし、TC分子は整理的環境下ではTH_2またはTHという中性または陰イオン型として存在することが知られており、もしH^+との逆輸送系であれば、その輸送過程は電気的に中性ではなく、少なくとも2個の正味の電荷の移動を伴う筈であり、観察された事実と矛盾する。我々は、第3のイオンが共輸送されている可能性を検討した。TC輸送系の活性にはMg^<2+>が必須であり、Co^<2+>は更に効率よくTC輸送を活性化するが、Cd^<2+> Mn^<2+> Zn^<2+>などは無効である。そこで60Co^<2+>の輸送を測定した所、TC耐性蛋白TetAに仲介されて、TCの輸送と共役したCoの輸送が認められた。Mg^<2+>またはCo^<2+>存在下では、TCは中性付近の溶媒中で、THMg^<+>またはTHCo^<+>という一価カチオンとして存在することが知られている。TetAにより輸送される分子が一価カチオンであればH<+>との交換により電気的中性となり、エネルギ-共役実験の結果と一致する。次に、THMg+とH+の技薬輸送の素過程を明らかにするため、基質結合部位またはエネルギ-共役部位に欠損を持つTetA蛋白を産生する変異株の単離を試みた。いくつかのTC耐性遺伝子の共通配列からTC結合部位と予想されている領域の近傍にあるEcoRVサイト付近に約100bp欠失を導入したところ、TetA蛋白が産生されているにもかかわらずTC感受性となる菌株が得られた。次年度においては、この変異株の性質を調べるとともに、更にエネルギ-共役部位と考えられているC末側ドメインに欠失を持った変異株を調製する。