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ミトコンドリアサイトパチーにおけるミトコンドリアDNA塩基配列の解析

线粒体细胞病中线粒体 DNA 碱基序列分析

基本信息

批准号：
62617520
负责人：
宝来聰
金额：
$ 0.77万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1987
资助国家：
日本
起止时间：
1987 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-62617520/
关键词：
ミトコンドリアサイトパチーミトコンドリアDNA DNA多型

项目摘要

近年ミトコンドリア・サイトパチー等の疾患において, ミトコンドリアゲノムの欠陥, あるいは関与が問題にされている. 患者試料は血液あるいは微量の生検組織に限られるため, 我々らが行って来たような精製したmtDNAを用いる分析は困難である. またサザンブロット法では, 分解能に限界があり, ゲノム中に大きな欠失・挿入があった場合にしか変化が観察されない. このため, 近年開発された変性剤濃度勾配電気泳動法(DGGE法)を用いた, mtDNAにおけるミスマッチの同定法への応用を試みた. 正常人2個体より精製したmtDNAの2.1KbのPst1断片をpUC19にクローニングした. この2個体のmtDNAのうち一方は制限酵素による分析でこのPst1断片中に9bpの欠失があることがわかっている. クローニングされた2種類のDNAを等量ずつ混ぜた後, 熱変性, 再結合するとホモデュプレックス2種類とヘテロデュプレックス2種類の混合物ができる. この混合物を, インサートをさらに切断するような制限酵素で消化し, DGGEにより泳動方向と平行に変性剤の濃度勾配をつけたゲルで, 60°C温度を保ちながら泳動する. ヘテロデュプレックス中に塩基置換等によるミスマッチがあると低い変性濃度二本鎖DNAの部分解離がおこり, その高次構造の変化によって易動度がおそくなるためホモデュプレックスと区別できる. 実際, 上述の混合物をRsaIで切断し, DGGEで分析すると, 一方に欠失のある相同断片同士のヘテロデュプレックスでは, かなりの易動度の遅滞がみられた. さらに別の断片のヘテロデュプレックスでも易動度の遅滞が観察され, シークエンスによる分析で, この2種類のmtDNA断片の塩基配列には1塩基置換があることが明らかになった. この方法では, ミトコンドリア・サイトパチーの患者試料を用いた場合でも正常人試料との比較によって, どの部位で塩基置換がしるかをまず決め, その後シークエンスにらる分析に発展できる利点がある.

In recent years, there has been an increase in the number of people suffering from diseases such as illness, illness, and other diseases in recent years. The patient's blood samples were collected, the blood samples were collected, the tissue samples were collected, and the tissue samples were collected. We asked for help to analyze the symptoms of mtDNA. In this way, the decomposition energy is limited, and in the middle of the analysis, there is a high level of energy loss in the system. In recent years, we have started to use the DGGE method, and the mtDNA method has been used in the same way. Two normal subjects were divided into mtDNA 2.1Kb Pst1 fragments and pUC19 spermatozoa. Two mtDNA fragments were analyzed by enzyme restriction enzyme analysis. 9bp was missing from the Pst1 fragment. In this paper, we use the same amount of information as the same amount of information in the DNA system, and then combine it with the same amount of information in the same amount of information. The mixture is cut off and the enzyme digestion is restricted. The swimming direction of DGGE is parallel to the temperature of 60 °C and the temperature is 60 °C. In order to improve the degree of mobility, the DNA of an ordinary university with a low degree of sex is partially dissociated. In this way, it is necessary to improve the mobility of ordinary universities. International, the above-mentioned mixture RsaI cut off, DGGE analysis, one side missing the same fragment, the same fragment. In order to improve the degree of mobility, we need to know how to improve the mobility of mtDNA fragments. In this paper, we compare the results of the analysis, analysis and analysis of different fragments. The method was used to compare the data of the patients with normal people, the location of the patient, the patient, the patient and the patient.