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フローサイトメータによるウエルシュ菌エンテロトキシン蛋白分子の作用機作の解析

流式细胞仪分析产气荚膜梭菌肠毒素蛋白分子的作用机制

基本信息

批准号：
63560291
负责人：
植村興
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Osaka Prefecture University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.ウエルシュ菌エンテロトキシン(ET)の精製。既報の方法でETを100mg精製した。2.ETに対するモノクローナル抗体(MCA)の調整。前年までに得たハイブリドーマから、4種類のMCAを調整した。3.Vero細胞を用いたフローサイトメトリー(FCM)によるET活性の測定法の開発。ETを作用させたVero細胞をfluorescein diacetateとpropidium iodideで二重染色後、FCMで解析することによる、ET活性の測定法を開発した。同法は、従来の、色素を取り込んだVero細胞を光学顕微鏡下で肉眼でカウントする方法に比べて測定時間、測定精度、手間等において格段に優れていた。4.FCMによるET活性の測定に用いる浮遊状細胞の検索。3.で開発した方法の欠点は、Vero細胞を調整する際にtrypsin処理を要することである。trypsin処理は細胞のレセプター及びETの構造あるいは活性に影響を与えることが知られているので、ET活性の精密な解析にはtrypsinの使用は避けたい。そこでtrypsin処理の不要な浮遊状培養細胞を探索した。維持の容易な5種類の浮遊状培養細胞を検討した結果、唯一FM3AがVero細胞に匹敵する感度を有し、Vero細胞に代わり得る細胞であることを明らかにした。5.ETの分子構造と生物活性に関する仮説の提示。既報及び1〜4を適用した実験の結果をまとめ、ETは、分子量1万5千のC末ドメインがET表面の大部分を占め、この部分で標的細胞へ結合することを図を用いて提示した。なお、分子量2万のN末のドメインの作用上の役割りを明らかにすることはできなかった。N末ドメインの作用機作の解析が今後の課題として残された。

1. The refinement of (ET). Both methods reported ET 100mg refined. 2. The adjustment of MCA. The year before last, four kinds of MCA were adjusted. 3. Development of an assay for ET activity in Vero cells using FCM. ET activity assay was developed after double staining and FCM analysis. The same method is superior to Vero cells in terms of measurement time, measurement accuracy, and manual time. 4. FCM was used to detect ET activity. 3. The development of new methods and Vero cell line adjustment in time for trypsin treatment Trypsin treatment affects the structure of cells and ET activity, and the precise analysis of ET activity prevents the use of trypsin. The treatment of trypsin is not necessary for the exploration of floating culture cells. It is easy to maintain the sensitivity of five kinds of floating culture cells, only FM3A can match Vero cells, and Vero cells can be cultured in vitro. 5. The molecular structure and biological activity of ET are suggested. Both reports and 1 ~ 4 are applicable. The results show that most of the molecular weight of ET is 15,000. The molecular weight of ET is 15,000. The molecular weight of 20,000 N terminal is not limited to the function of N terminal. The analysis of the action mechanism of the N terminal is a future problem.