豚IL-2の基礎的解明および大量培養について

猪IL-2的基本阐明和大规模培养

• 批准号: 63560303
• 负责人: 井上 武
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Yamaguchi University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1988
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1988 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-63560303/
• 关键词: 豚IL-2; 豚IL-2活性のMTT法による検定; 豚IL-2の産生状件; 豚IL-2の性状; 豚IL-2の大量培養法

1.豚IL-2の検定法:3H-TdR取り込み法により豚血液リンパ球のPHA刺激培養上清中のIL-2活性を測定した結果、ラットIL-2と同様、マウスIL-2依存性細胞株であるCTLL細胞を濃度依存性に増殖させた。MTT法による測定では、3H-TdR取り込み法と同様に濃度依存性の増殖が見られ、測定感度にも大きな差は認められず、CTLL細胞の増殖をMTT法で測定することにり豚IL-2活性の測定が可能であることが確認された。2.豚IL-2の産生条件:豚血液リンパ球をPHAで刺激した場合の至適条件細胞濃度5×10^6個/ml、PHA2.5-5.0μg/、培養時間48時間であった。ConAでは細胞濃度5×10^6個/mlConA5.0μg/ml、培養時間72時間で最も高いIL-2活性が得られた。一方、腸間膜リンパ節由来リンパ球では、PHAの場合、細胞濃度1×10^7個/ml、PHA濃度10μg/ml、培養時間24-48時間で高いIL-2活性が得られた。3.豚IL-2の性状:ゲル濾過法により測定した豚IL-2の分子量は32,000-45,000daltonで、クロマトフォーカシングによる等電点はpH4.6-6.2であった。また豚IL-2はトリプシン処理、70℃熱処理、8M尿素処理では50%以上の活性低下を示したが、37℃および56℃熱処理、酸(pH3.2)およびアルカリ(pH10.5)、4Mおよび2M尿素、2-MEならびに、イラミニダーゼ処理には安定であり、ヒトおよびマウスIL-2と類似した性状を示すことが確認された。4.大量培養:2.の産生条件をもとに、容易に分離できる腸間膜リンパ節由来リンパ球を大量培養に用いた。細胞濃度を1×10^7個/mlに調製し、PHA5μg/mlを添加した後、5%CO_2存在下で攪拌培養(33rpm)した結果、培養12時間後から高いIL-2活性が検出され、以後96時間まで高値を維持した。一方、ConA5μg/mlで刺激した場合、培養36時間で最も高い活性を示したが、PHA刺激に比較してIL-2産生の発現が遅く、活性も低値であった。5展開:4.により得られたIL-2を利用して、豚Tリンパ球の長期培養、株化、免疫村構の解析、応用を行う。

1. IL-2 assay: 3H-TdR assay, IL-2 activity assay in PHA-stimulated culture supernatant of pig blood cells, IL-2 isoforms, IL-2 dependent cell lines, and concentration-dependent proliferation of CTLL cells MTT assay, 3H-TdR assay, concentration-dependent proliferation assay, sensitivity assay, CTLL cell proliferation assay 2. The optimal conditions for IL-2 production were as follows: 5×10^6 cells/ml, PHA 2.5 -5.0μg/ml, culture time 48 hours. ConA concentration of 5×10^6 cells/ml ConA 5.0 μg/ml, culture time 72 hours, the highest IL-2 activity was obtained. When PHA was used, IL-2 activity was increased at a cell concentration of 1×10^7 cells/ml, PHA concentration of 10μg/ml, culture time of 24-48 hours. 3. The molecular weight of IL-2 is 32,000- 45,000 dalton, and its isoelectric point is pH4.6-6.2. IL-2 activity decreased by more than 50% after heat treatment at 70℃ and 8M urea treatment. IL-2 activity decreased by more than 50% after heat treatment at 37℃ and 56℃, acid (pH 3.2) and acid (pH 10.5), 4M urea and 2M urea treatment. IL-2 activity decreased by more than 50% after heat treatment at 70 ℃ and 8 M urea treatment. 4. Mass culture:2. Production conditions: easy to isolate, easy to isolate, easy to culture, easy to culture, easy to culture. IL-2 activity increased from 1×10^7 cells/ml to 33rpm in the presence of 5% CO_2 after PHA5μg/ml was added. IL-2 activity increased from 12 hours to 96 hours. The highest activity was observed when stimulated with 5μg/ml of ConA and incubated for 36 days. The highest activity was observed when stimulated with PHA and the lowest activity was observed when stimulated with PHA. 5. Development:4. Long term culture, isolation, immune structure analysis and application of IL-2.