モノクローナル抗体によるポリADPリボース合成酵素の生理的役割の解析

使用单克隆抗体分析聚 ADP-核糖合成酶的生理作用

• 批准号: 63570118
• 负责人: 宇城 啓至
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Kochi Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1988
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1988 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-63570118/
• 关键词: ポリADPリボース合成酵素; クロマチン蛋白; モノクローナル抗体; マイクロインジェクション; 核局在シグナル

ポリADPリボース合成酵素は、細胞核内に局在し、細胞増殖の制御や細胞DNA鎖の損傷修復に関与していることが示唆されている。しかしながら、これらの過程の分子レベルでの機作については未だ不明な点が多い。そこで報告者らは、本酵素に対するモノクローナル抗体を用いて本酵素の役割を解明することを試みた。1)抗体を細胞核内に導入するため、抗体IgGのFab断片を調製した。更に、SV40ウィルスのラージT抗原の核局在シグナルを含むペプチド(アミノ酸残基数12)を抗体IgGに結合させた。このFabと修飾IgGは抗体活性を保持しており、試験管内では本酵素活性を完全に阻害した。2)Fab及び修飾IgGを培養細胞(HeLa細胞、ヒト線維芽細胞など)にガラス細管を介して注入し、Fabは3時間後、修飾IgGは30分後には大部分が核内に移行していることを免疫組織化学的に確認した。3)細胞のDNA及びRNA合成に対する抗体の影響を調べるため、抗体を注入した細胞に3Hチミジン又は3Hウリジンをとりこませた。いずれの場合も対照(本酵素活性を阻害しない抗体を注入した細胞)との間に有意な差はみられなかった。4)ジメチルサルフェイトにより抗体導入細胞のDNA鎖を損傷させ、細胞のRNA合成能の回復を^3Hウリジンのとりこみで調べたところ、これも対照との間に有意な差はみられなかった。これらの結果から、本酵素は細胞内で充分量存在し、その一部分を阻害しただけでは細胞のDNAやRNAの合成能、及びDNA損傷修復能に影響を与えないことが明らかになった。今後、本酵素の役割を解明するためには、本酵素の生合成を抑制し、かつ充分量の抗体を細胞核内に導入することが必要と考えられる。そこで現在、本酵素cDNA解析中にみつかった酵素の多型性を考慮しながら、ゲノムDNAを解析して、本酵素の発現調節機構を究明することを急いでいる。

ポ リ ADP リ ボ ー ス synthetic enzyme は, に bureau raised colonization in し, cells in the nuclei の suppression や cell lock の DNA damage repair に masato and し て い る こ と が in stopping さ れ て い る. し か し な が ら, こ れ ら の process の molecular レ ベ ル で の machine for に つ い て は not unknown だ な が い more. そ こ で reporter ら は, this enzyme に す seaborne る モ ノ ク ロ ー ナ を ル antibody with い て this enzyme cut を の service interpret す る こ と を try み た. 1) The antibody を is introduced into the nucleus に for するため, and the antibody IgG is divided into <s:1> Fab fragments を for modulation of た た. More に, SV40 ウ ィ ル ス の ラ ー ジ T antigen の nuclear agency in シ グ ナ ル を containing む ペ プ チ ド (ア ミ ノ acid residue base 12) を に combined with antibody IgG さ せ た. <s:1> <s:1> Fabと modifies the activity of IgG <s:1> antibody を, maintains the activity of <s:1> てお and in the test tube を, and completely に inhibits the activity of this enzyme た. 2) the Fab and modified IgG び を cultured cells (HeLa, ヒ ト line d bud cells な ど) に ガ ラ ス tubule を interface し て injection し, Fab は は 30 minutes after 3 time stops, or qualifying IgG に は に within most が nuclear migration し て い る こ と を immunohistochemical に confirm し た. 3) cells の び RNA and DNA synthesis に す seaborne の る antibody を adjustable べ る た め, antibody を injection し た cells に 3 h チ ミ ジ ン は again 3 h ウ リ ジ ン を と り こ ま せ た. い ず れ も の occasions as seaborne (this enzyme activity を resistance against し な を い antibody injection し た cells) と の に intentionally な difference between は み ら れ な か っ た. 4) ジ メ チ ル サ ル フ ェ イ ト に よ り antibody の DNA lock を import cell damage さ せ の RNA synthesis, cell can reply を の ^ 3 h ウ リ ジ ン の と り こ み で adjustable べ た と こ ろ, こ れ も polices according to と の に intentionally な difference between は み ら れ な か っ た. Results こ れ ら の か ら で full quantity, this enzyme は cell し, そ の part を resistance against し た だ け で は cells の の や RNA synthesis of DNA, and び DNA damage repair can affect を に with え な い こ と が Ming ら か に な っ た. In the future, this enzyme cut を の service interpret す る た め に は, this enzyme の biosynthesis を し, か つ full amount の antibody を に import in the nuclei す る こ と が と necessary test え ら れ る. そ こ で now, this enzyme cDNA analytic に み つ か っ た enzyme の polytypism を consider し な が ら, ゲ ノ ム DNA を parsing し て, this enzyme の 発 now regulating mechanism on Ming す を る こ と を urgent い で い る.

项目成果

Yutaka Shizuta: "ADPーRibose Transfer Reactions:Mechanisms and Biological Significance" Springer-Verlag, (1989)

Yutaka Shizuta：“ADP-核糖转移反应：机制和生物学意义”Springer-Verlag，（1989）

Katsumi Toda: FEBS Letters. 印刷中. (1989)

户田克己：FEBS 信件出版中（1989 年）。

Hiroshi Ushiro: "ADPーRibose Transfer Reactions:Mechanisms and Biological Significance" SpringerーVerlag, (1989)

Hiroshi Ushiro：“ADP-核糖转移反应：机制和生物学意义”Springer-Verlag，（1989）