コレラ菌線毛遺伝子のクローニングとその発現機構

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コレラ菌には数種類の線毛が存在するといわれている。我々は殆ど全て のコレラ菌に存在する径約7nmの糸状線毛に着目し、先ず効率のよい線毛精製法を 確立した。患者分離株82P7から精製した線毛はヒトおよびヒツジ赤血球を凝集さ せ、サブユニット蛋白の分子量は約16,000であった。精製線毛を抗原として特 異性の高い抗血清を得た。コレラ菌の腸粘膜定着阻止実験は、コレラ菌を抗線毛抗体 Fabで前処理する方法および腸粘膜を精製線毛で前処理する方法を用いて行った。この二つの方法で、コレラ菌の腸上皮定着を阻止することは出来なかった。 非定着性コレラ菌 (毒素は産生する) から精製した線毛は、赤血球凝集性・形態・分 子量・免疫学的反応のいずれにおいても定着生コレラ菌の線毛と区別することは出来 なかった。コレラ菌の定着因子と16K線毛の関係を遺伝子レベルで確認するため、線毛遺伝子のクローニングを試みた。先ず定着性コレラ菌82P7株から得たクロモゾームを制限酵素EcoRIおよびHindIIIによって切断した2種類のgene bankを作成した。最初にHindIII断片をベクタープラスミドpVC19のHindIII部位に結合させたもので大腸菌JM109の形質転換を行った。現れたコロニーの90%以上は82P7株のクロモゾーム断片をとり込んでいた。個々のコロニーをLBブロスで増菌し、そのwhole cell lysateをSDS電気泳動で分画した。更にその分画 (蛋白) と抗線毛抗体のインムノブロットを行い、コレラ菌16K線毛が発現している株を探した。現在までに396コロニーを検査したが、16K線毛蛋白を発現した株は未だに見つかっていない。1,000コロニーを検査して発現株が見つからない場合はEcoRI断片のgene bankを用いる予定であり、また検出作業の能率を考慮し今後はELISA法をスクリーニングテストとして用いる予定である。