ヒト尿由来巨核球増殖刺激因子の精製と遺伝子クローニング

人尿源性巨核细胞生长刺激因子的纯化及基因克隆

• 批准号: 63570575
• 负责人: 河北 誠
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1988
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1988 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-63570575/
• 关键词: 巨核芽球細胞株増殖刺激因子; 再生不良性貧血患者尿; 大量精製

巨核球血小板系造血に関与する因子の研究は遅れている。その一つの原因として、活性測定法に鋭敏かつ再現性に富む方法がないことである。in vitroで巨核球コロニー形成を刺激するMeg-CSFは、従来報告された活性の殆どがIL-3によるとされている。しかしIL-3は巨核球系に特異的な因子ではなく、本造血系に特異的な刺激因子が存在することは充分に考えられる。我々は従来再生不良性貧血(再不貧)患者尿中に巨核球血小板造血を刺激する因子が存在することを報告し、その精製を試みてきたが、活性測定法が充分でなく、精製に困難をきたしていた。今回ヒト巨核芽球性細胞株CMKを入手し、それから得た亜株CMK-308が再不貧患者尿抽出物に反応して増殖することを見いだし、これを指標として活性因子の精製と遺伝子クローニングを試みている。前年度迄に小スケールの予備実験を行い、本因子がpI4〜5の酸性粁蛋白であることが推定されている。今年度は主に大量精製のための予備実験を行った。まず再不貧患者尿100lから得た粗標品(蛋白量として約2g)をDEAEセファロースにより分画した。標品を0.05M燐酸緩衝液(pH55)に溶解して展開後吸着画分を1.2MNaClで溶出した。CMK増殖活性は主に非吸着画分に回収されたが、一部吸着画分にも認められた。そこでまず非吸着画分に含まれる活性についてSP-5PWによる高速液体クロマトグラフィーを試みた。溶媒Aとして7M尿素を含むグリシン塩酸緩衝液(0.02M,pH3.5)、Bとして1MNaClを含むグリシン塩酸緩衝液を用いた。活性は40%Bの位置に単一なピークとして溶出された。そこで大量精製の第一歩として尿500l分の粗標品から出発し、DEAEセファロース、SP-5PWの2段階の部分精製標品を得た。現在100iから出発した標品について、種々のレクチンカラム、逆相系高速液体のロマトグラフィーを行い、精製条件を検討中である。

The study of factors involved in megakaryocyte platelet hematopoiesis The reason for this is that the activity determination method is sensitive and reproducible. In vitro, Meg-CSF and IL-3 activity are reported to stimulate megakaryocyte formation. IL-3 is a megakaryocyte lineage-specific factor and a hematopoietic lineage-specific stimulatory factor. We report the presence of megakaryocyte platelet stimulating factors in the urine of patients with aplastic anemia (AA) in the past, and we try to refine them. Activity assays are sufficient and difficult to refine. Now, the megakaryocytic cell line CMK was developed and the target cell line CMK-308 was obtained. The target cell line CMK-308 was used to detect the activity of the active factors in urine extracts from patients with chronic anemia. In the past year, the preparation of small proteins has been carried out, and this factor has been estimated to be pI4 ~ 5 and acidic proteins. This year, the main body of the company has a large number of refined products. The crude standard (protein content: about 2 g) was obtained from urine of patients with severe anemia. The standard was dissolved in 0.05M phosphate buffer (pH55) and eluted in 1.2M NaCl. CMK is active in non-sorption reactions, and some sorption reactions occur. The SP-5PW is a high-speed liquid. Solvent A and B were used in a mixture of 7M urea and 1 M NaCl containing hydrochloric acid buffer (0.02 M, pH 3.5). Activity: 40% of the position is dissolved. The first step of mass purification was to obtain the crude standard of 500 minutes, DEAE, SP-5PW and the partially refined standard of 2 stages. Now 100i

项目成果

Obata,S.: Jpn.J.Clin Oncol. 18. 335-342 (1988)

Obata，S.：Jpn.J.Clin Oncol。

河北誠: "血液幹細胞「トロンボポエチン」" 西村書店, (1989)

川北诚：“血液干细胞“血小板生成素””西村书店，（1989）

Tsuda,H.: Cyclic monophosphate not as a second message but as a regulator of cell growth Experimental Hematology. (1989)

Tsuda,H.：环单磷酸盐不是第二条信息，而是作为细胞生长实验血液学的调节剂。

Tuda,H.et al: Experimental Hematology. in press. (1989)

Tuda,H.et al：实验血液学。

松見信太郎: 九州血液研究同好会誌. 36. 33-38 (1988)

松美慎太郎：九州血液研究俱乐部杂志 36. 33-38 (1988)。