ヒト尿由来巨核球増殖刺激因子の精製と遺伝子クローニング

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巨核球血小板系造血に関与する因子の研究は遅れている。その一つの原因として、活性測定法に鋭敏かつ再現性に富む方法がないことである。in vitroで巨核球コロニー形成を刺激するMeg-CSFは、従来報告された活性の殆どがIL-3によるとされている。しかしIL-3は巨核球系に特異的な因子ではなく、本造血系に特異的な刺激因子が存在することは充分に考えられる。我々は従来再生不良性貧血(再不貧)患者尿中に巨核球血小板造血を刺激する因子が存在することを報告し、その精製を試みてきたが、活性測定法が充分でなく、精製に困難をきたしていた。今回ヒト巨核芽球性細胞株CMKを入手し、それから得た亜株CMK-308が再不貧患者尿抽出物に反応して増殖することを見いだし、これを指標として活性因子の精製と遺伝子クローニングを試みている。前年度迄に小スケールの予備実験を行い、本因子がpI4〜5の酸性粁蛋白であることが推定されている。今年度は主に大量精製のための予備実験を行った。まず再不貧患者尿100lから得た粗標品(蛋白量として約2g)をDEAEセファロースにより分画した。標品を0.05M燐酸緩衝液(pH55)に溶解して展開後吸着画分を1.2MNaClで溶出した。CMK増殖活性は主に非吸着画分に回収されたが、一部吸着画分にも認められた。そこでまず非吸着画分に含まれる活性についてSP-5PWによる高速液体クロマトグラフィーを試みた。溶媒Aとして7M尿素を含むグリシン塩酸緩衝液(0.02M,pH3.5)、Bとして1MNaClを含むグリシン塩酸緩衝液を用いた。活性は40%Bの位置に単一なピークとして溶出された。そこで大量精製の第一歩として尿500l分の粗標品から出発し、DEAEセファロース、SP-5PWの2段階の部分精製標品を得た。現在100iから出発した標品について、種々のレクチンカラム、逆相系高速液体のロマトグラフィーを行い、精製条件を検討中である。