巨核球の増殖分化を刺激する新しいサイトカインの純化と遺伝子クロ-ニング

刺激巨核细胞增殖和分化的新型细胞因子的纯化和基因克隆

• 批准号: 03671192
• 负责人: 河北 誠
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03671192/

本年度はヒト巨核球性白血液細胞株CMKの増殖を刺激する因子の純化を試みた。活性測定はCMKより当科で樹立した樹立した亜株CMKー308を用いたMTT法によった。ヒト成人T細胞白血病由来HTLVーI感染T細胞株K3Tの無血清培養上清200Lを出発材料とした。まずYMー10限外ろ過膜により濃縮坂DEAEーセファロ-ズCLー6Bカラム,次いでブル-セファロ-CLー6Bカラムにて分画した。得られた活性画分をDZAZー5PW高速液体クロマトグラフィ-(HPLC)により分画したところNacl濃度の0.1M及び0.2Mの位置に2つの活性画分を得た(FrI,II)。次に2つの画分をHCAーHPLCで分画したところ,FrIは単一の活性ピ-ク,FrIIは更に2つの活性ピ-ク(FrIIa,IIb)に分画された。この時点で各種サイトカインに対する抗体による中和試験を行った。その結果,画分IIa及びIIbは抗GMーCSF抗体,抗ILー3抗体,抗ILー6抗体の混合溶液でほぼ完全に中和された。更に各抗体の単独添加では抗GMーCSF抗体により、中和されたところから、IIa,IIn画分中の殆どがGMーCSFによると推定された。しかしFrIaの活性はこれらの抗体では中和されず,GMーCSF,ILー3,ILー6以外の因子が存在すると考えられる。一方K3Tの各種因子の産生をmRNAのレベルでPCR法を用いて解析した。その結果K3Tは無血清培養ではMーCSF,GMーCSF,ILー1α,ILー6,ILー9,TGFーβのmRNAの発現が認められた。しかしMーCSF,ILー1,ILー9,TGFーβにはCMKには反応せず,またFrIの活性はGMーCSF,ILー3,ILー6抗体では中和されないことから,これら既知因子以外の新しいサイトカインが含まれる可能性が示唆された。更にCMKの巨核球系表面形値である血小板膜粁蛋白IIb/IIIaの発現を検討すると,K3T培養上清は、IIb/IIIaの発現率を15%から50%へ上昇させるが,この活性もGMーCSF,ILー3,ILー6に対する抗体では中和されなかった。現在FrIの活性について,更に培養上清を大量調製して精製を試みている。

This year, we tried to purify the factors that stimulate the proliferation of megakaryocytic leukocytes CMK. Activity assay CMK 308 was established by MTT assay. Adult T cell leukemia originated from HTLV-1 infected T cell line K3T and 200L supernatant of serum-free culture was used to develop the material. YM-10 limit through the membrane, concentrated DEAE-CL-6B system, secondary DEAE-CL-6B system analysis DZAZ-5PW high speed liquid chromatography (HPLC) was used to determine the activity of Nacl at 0.1M and 0.2M (FrI,II). The next step is to analyze HCA by HPLC,FrI by HPLC, FrII by HPLC, FrIIa by HPLC, FrIIb by HPLC, FrIIb by HPLC, FrIIa by HPLC, FrIIa by HPLC, FrIIb by HPLC. This is the first time that I've seen this. As a result, the mixture of anti-GM-CSF antibody, anti-IL-3 antibody and anti-IL-6 antibody was completely neutralized in both IIa and IIb. In addition, each antibody was added independently of the anti-GM-CSF antibody, neutralizing, neutralizing, neutralizing. The activity of FrIa is not detected by neutralizing antibodies, and factors other than GM CSF,IL 3 and IL 6 are present. PCR was used to analyze the mRNA expression of K3T The results showed that K3T was able to detect the mRNA expression of M CSF,GM CSF,IL 1α,IL 6,IL 9,TGF β in serum-free culture. M-CSF,IL-1,IL-9,TGF-β antibodies are counteractive to FrI, and the activity of M-CSF,IL-3,IL-6 antibodies is counteractive, indicating the possibility of new factors other than known factors. In addition, the expression of platelet membrane protein IIb/IIIa in the supernatant of K3T culture increased from 15% to 50%, and the activity of antibodies against GM CSF,IL-3,IL-6 was neutralized. Now FrI activity is very important, and culture supernatant is very important.

项目成果

Fujimoto,K.,et al: "Purification of megahary ocyte differenliation activity from a human fibrous histiocytoma cell line:NーTerminal sequence homology with actimin A." Biochem.Biophys.Res.Commun.174. 1163-1168 (1991)

Fujimoto, K., 等人：“从人纤维组织细胞瘤细胞系中纯化巨噬细胞差异化活性：与 Actimin A 的 N 端序列同源性。”Biochem.Biophys.Res.Commun.1163-1168（1991）。

藤本 幸示 他: "末分化甲状腺癌由来細胞株上清より純化した巨核球系細胞分化因子についてーアクチビンの新しい生物活性の発見ー" 臨床血液.

Koji Fujimoto 等人：“从终末分化甲状腺癌衍生细胞系上清液中纯化的巨核细胞分化因子 - 激活素新生物活性的发现”临床血液。

Yonemura,Y.,et al: "Synergistic effects of in terleukinー11 on murine megakaryopoiesis in serumーfree cultcere." Exp.Hematil,.

Yonemura, Y., 等人：“terleukin-11 对无血清培养皿中小鼠巨核细胞生成的协同作用。”

Yonemura,Y.et al: "Effects.of short term aclministration of reconbinant human erythropoletin on rat megaharyopoiesis." Int J.Cell Cloning. 10. 18-27 (1992)

Yonemura，Y.et al：“短期使用重组人红细胞生成素对大鼠巨细胞生成的影响”。