新しいCa指示薬を用いた骨格筋細胞内Ca濃度変化とその制御因子の追跡

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1.新しいカルシウム指示薬の開発とテスト:TMX(tetramethylmurexide)は、反応速度の速い点、細胞内蛋白や細胞内小器官への結合が少ない点から、現在、市販されているカルシウム指示薬の中で、理想的なカルシウム指示薬に最も近い色素である。しかし、TMXは筋小胞体膜に対する透過性を有するため、筋細胞内のカルシウム濃度の測定に適用するには問題があった。そこで、TMXの利点はそのまま保ち、筋小胞体膜に対する透過性のみをなくした色素を作る目的で、TMXの側鎖を変えた種々のアナログを合成しテストした。その結果TMXの2つのメチル基をアセチル基に置換したDMPDAA(dimethylpurpurate-diacetic acid)と、さらに残りの2つのメチル基を外しHに戻したPDAA(purpurate-diacetic acid)が選びだされた。2.骨格筋標本におけるカルシウム濃度の測定:骨格筋カットファイバ-標本を作製し、二重ワセリン隔絶法により、単収縮刺激及び加重刺激に伴うカルシウムの濃度変化を光学的に測定し、解析した。この結果TMXで問題となった基線の移動のないCa-transientを記録することに成功した。このことから新しいカルシウム指示薬は筋小胞体膜に対する透過性がないと考えられる。筋細胞内でfreeの状態にあるPDAAの割合は、約81%であると結論づけられた。これは、これまでに知られているカルシウム指示薬では最も大きい値である。一方、PDAAで測定した時の単収縮時Ca-transientのピ-ク値は20ー30μMとこれまでの報告より数倍〜十数倍大きい値となり、これまでの報告はカルシウム指示薬の細胞内蛋白との結合のため、相当低い値に見積られていた可能性が強く示唆された。