チミンダイマ-除去修復機構の合成遺伝子による解析

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T4エンドヌクレア-ゼVのC末端の芳香族アミノ酸クラスタ-がチミンダイマ-を含む二本鎖DNAの結合に関与することは容易に推定されるので、この付近の変異体であるT127M、W128AW128S、Y129A、K130L、Y131Aについてin vitroおよびin vivoの活性を測定した。in vitro活性測定には通常、UV照射したpoly(dT)・poly(dA)やプラスミドが用いられるが、反応速度などを詳しく調べるために、2本鎖中にチミンフォトダイマ-を一個のみ持つ基質を合成した。鎖長10、14、18のオリゴデオキシヌクレオチドとその相補鎖を合成した。フィルタ-を用いる解離定数の測定では鎖長10の二本鎖は結合が観察されなかった。14量体と18量体の二本鎖の解離定数は1.1×10^<ー9>Mと1.2×10^<ー9>Mであった。チミンフォトダイマ-を含む一本鎖は酵素濃度を大きくすると切断されることがわかったが、アフィニティ-は約1/100と推定された。14量体と18量体二本鎖のKm値はそれぞれ19×10^<ー9>Mと9×10^<ー9>Mであり、ほとんど差はないと考えられる。変異体酵素のピリミジンダイマ-グリコシラ-ゼ活性は上記基質を用いて反応後、ピペリジン処理し、鎖切断を5'末端のリンの放射性同位元素を定量することにより観察した。Typ128をAlaに変えた場合はほとんど活性がなくSerに変えた場合には低い活性を示した。Tyr129は特に重要で、Tyr131、132はAlaに変換してもある程度の活性を示した。