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チミンダイマ-除去修復機構の合成DNAによる解析

利用合成 DNA 分析胸腺嘧啶二聚体去除修复机制

基本信息

批准号：
03152001
负责人：
大塚栄子
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

T4エンドヌクレア-ゼVのX線による構造解析から推定される基質結合付近の塩基性アミノ酸を変換することにより、Arg3、Arg22、Arg26がPDグリコシラ-ゼ活性に重要な残基であることがわかった。Arg3をGlnに変えると活性が完全に消失する。また、立体的にこの近傍にあるGlu23をGlnに変えた場合にもPDグリコシラ-ゼ活性は消失する。興味深いことにGlu23をAspに変換してメチレン基を一個少くした場合にもこの活性が全くなくなることがわかった。さらに、Arg3をLysに変えた場合、Arg26をLysまたはGlnに変えた場合にはKmの増大が観察されたことから、これらの残基が基質との結合に重要であることが推定される。チミンダイマ-を一個含むオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成し、相補鎖と合わせて二本鎖を形成させ基質とした後、これらの変異体蛋白を加えて、CDスペクトルの変化を調べたところ、Glu23をGlnに変えた変異体は基質の高次構造に大きな変化を与えることがわかった。この変異体はチミンダイマ-を含まない二本鎖14merのCDスペクトルには変化を与えないことから、チミンダイマ-DNAに対する特異的結合能を有するものと思われる。つまりこの変異体は基質と結合するが触媒活性のない蛋白であり、基質との共結晶化に適したものである。次に塩基部を持たないアベ-シックサイトを一箇所含むデオキシリボヌクレオチドを合成し、変異体の二段階目のAPエンドヌクレア-ゼ活性を調べた。ほとんどの変異体は大量に用いたときには鎖を切断するがGlu23をGlnに変えたものは全く活性を示さなかった。Glu23をAspに変えると一段階目の反応は全く進行しないがアベ-シックサイトがあると、わずかにβー脱離を起こして鎖を切断することがわかった。この時に至適pHがわずかに酸性側となることを見出した。

T4-Arg-3, Arg-22, Arg-26 are important residues in PD-activity. Arg3 is completely inactive. In the case of a three-dimensional object, the Glu23 is removed. Glu23 Asp is the most active in a small number of cases. Arg3, Arg26, Arg26, Ar A new type of heteroprotein was synthesized and locked in the matrix, and then the heteroprotein was added to the matrix. Glu23 was transformed into a new type of heteroprotein. The binding energy of the 14-mer CD is different from that of the 14-mer CD The binding of heterogeneous substrates to catalytically active proteins and the co-crystallization of substrates Second, the base of the base A lot of things happen to you. When Glu23 changes to Asp, a series of reactions are carried out completely, and the lock is cut off. The pH value of the solution was determined by the pH value.