チミンダイマ-除去修復機構の合成DNAによる解析

利用合成 DNA 分析胸腺嘧啶二聚体去除修复机制

• 批准号: 03152001
• 负责人: 大塚 栄子
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Cancer Research
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03152001/
• 关键词: T4エンドヌクレア-ゼV; DNAグリコシダ-ゼ; DNAエンドヌクレア-ゼ; アベ-シックDNA

T4エンドヌクレア-ゼVのX線による構造解析から推定される基質結合付近の塩基性アミノ酸を変換することにより、Arg3、Arg22、Arg26がPDグリコシラ-ゼ活性に重要な残基であることがわかった。Arg3をGlnに変えると活性が完全に消失する。また、立体的にこの近傍にあるGlu23をGlnに変えた場合にもPDグリコシラ-ゼ活性は消失する。興味深いことにGlu23をAspに変換してメチレン基を一個少くした場合にもこの活性が全くなくなることがわかった。さらに、Arg3をLysに変えた場合、Arg26をLysまたはGlnに変えた場合にはKmの増大が観察されたことから、これらの残基が基質との結合に重要であることが推定される。チミンダイマ-を一個含むオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成し、相補鎖と合わせて二本鎖を形成させ基質とした後、これらの変異体蛋白を加えて、CDスペクトルの変化を調べたところ、Glu23をGlnに変えた変異体は基質の高次構造に大きな変化を与えることがわかった。この変異体はチミンダイマ-を含まない二本鎖14merのCDスペクトルには変化を与えないことから、チミンダイマ-DNAに対する特異的結合能を有するものと思われる。つまりこの変異体は基質と結合するが触媒活性のない蛋白であり、基質との共結晶化に適したものである。次に塩基部を持たないアベ-シックサイトを一箇所含むデオキシリボヌクレオチドを合成し、変異体の二段階目のAPエンドヌクレア-ゼ活性を調べた。ほとんどの変異体は大量に用いたときには鎖を切断するがGlu23をGlnに変えたものは全く活性を示さなかった。Glu23をAspに変えると一段階目の反応は全く進行しないがアベ-シックサイトがあると、わずかにβー脱離を起こして鎖を切断することがわかった。この時に至適pHがわずかに酸性側となることを見出した。

T4 エ ン ド ヌ ク レ ア - ゼ V の X-ray に よ る structure か ら presumption さ れ る matrix combined with paying nearly の salt basic ア ミ ノ acid を variations in す る こ と に よ り, Arg3, Arg22, Arg26 が PD グ リ コ シ ラ actiity ゼ に important な residues で あ る こ と が わ か っ た. Arg3をGlnに becomes えると activity が complete に disappearance する. ま た, three-dimensional に こ の nearly alongside に あ る Glu23 を Gln に - え た occasions に も PD グ リ コ シ ラ - は ゼ disappeared す る. Interest as deep い こ と に Glu23 を Asp に variations in し て メ チ レ ン base を a little く し た occasions に も こ の activity が total く な く な る こ と が わ か っ た. さ ら に, Arg3 を Lys に - え た occasions, Arg26 を Lys ま た は Gln に - え た occasions に は Km の raised large が 観 examine さ れ た こ と か ら, こ れ ら の residues が matrix と の combining に important で あ る こ と が presumption さ れ る. チ ミ ン ダ イ マ - を contains a む オ リ ゴ デ オ キ シ リ ボ ヌ ク レ オ チ ド を synthetic し, fill phase lock と わ せ て 2 lock を form さ せ matrix と し た, こ れ ら の - foreign proteins を plus え て, CD ス ペ ク ト ル の variations change を adjustable べ た と こ ろ, Glu23 を Gln に - え た - は matrix allograft の high times tectonic に き な を and え variations Youdaoplaceholder0 とがわ った った. こ の - variant は チ ミ ン ダ イ マ - contains を ま な い 2 lock killing 14 の CD ス ペ ク ト ル に は variations change with え を な い こ と か ら, チ ミ ン ダ イ マ - DNA に す seaborne る specific binding energy を have す る も の と think わ れ る. つ ま り こ の - と は matrix allograft combined with す る が catalytic activity の な い protein で あ り, matrix と の total crystallization に optimum し た も の で あ る. Time に salt base を hold た な い ア ベ - シ ッ ク サ イ ト を contained a む デ オ キ シ リ ボ ヌ ク レ オ チ ド を synthetic し, 1 - の Duan Jie mesh の AP エ ン ド ヌ ク レ ア - ゼ activity を adjustment べ た. ほ と ん ど の - variant は most に い た と き に は lock を cut す る が Glu23 を Gln に - え た も の は く all active を shown さ な か っ た. Glu23 を Asp に - え る と Duan Jie mesh の opposite 応 は く completely し な い が ア ベ - シ ッ ク サ イ ト が あ る と, わ ず か に beta ー from を up こ し て lock を cut す る こ と が わ か っ た. When に に reaches the optimal pHがわず となる に に the acidic side となる となる とを とを is observed to た た.

项目成果

Naoko Hori: "Photo affinity labeling of T4 endonuclease V with a substrate containing a phenyldiazirine derivative" J.Biol.Chem.

Naoko Hori：“用含有苯基二氮丙啶衍生物的底物对 T4 核酸内切酶 V 进行光亲和标记”J.Biol.Chem。