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チミンダイマ-除去修復機構の合成DNAによる解析

利用合成 DNA 分析胸腺嘧啶二聚体去除修复机制

基本信息

批准号：
03152001
负责人：
大塚栄子
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

T4エンドヌクレア-ゼVのX線による構造解析から推定される基質結合付近の塩基性アミノ酸を変換することにより、Arg3、Arg22、Arg26がPDグリコシラ-ゼ活性に重要な残基であることがわかった。Arg3をGlnに変えると活性が完全に消失する。また、立体的にこの近傍にあるGlu23をGlnに変えた場合にもPDグリコシラ-ゼ活性は消失する。興味深いことにGlu23をAspに変換してメチレン基を一個少くした場合にもこの活性が全くなくなることがわかった。さらに、Arg3をLysに変えた場合、Arg26をLysまたはGlnに変えた場合にはKmの増大が観察されたことから、これらの残基が基質との結合に重要であることが推定される。チミンダイマ-を一個含むオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成し、相補鎖と合わせて二本鎖を形成させ基質とした後、これらの変異体蛋白を加えて、CDスペクトルの変化を調べたところ、Glu23をGlnに変えた変異体は基質の高次構造に大きな変化を与えることがわかった。この変異体はチミンダイマ-を含まない二本鎖14merのCDスペクトルには変化を与えないことから、チミンダイマ-DNAに対する特異的結合能を有するものと思われる。つまりこの変異体は基質と結合するが触媒活性のない蛋白であり、基質との共結晶化に適したものである。次に塩基部を持たないアベ-シックサイトを一箇所含むデオキシリボヌクレオチドを合成し、変異体の二段階目のAPエンドヌクレア-ゼ活性を調べた。ほとんどの変異体は大量に用いたときには鎖を切断するがGlu23をGlnに変えたものは全く活性を示さなかった。Glu23をAspに変えると一段階目の反応は全く進行しないがアベ-シックサイトがあると、わずかにβー脱離を起こして鎖を切断することがわかった。この時に至適pHがわずかに酸性側となることを見出した。

T4 エンドヌクレア-ゼVのX-ray による structural analysis から inferred される matrix binding close の塩 basic アミノ acid を変change することにより, Arg3, Arg22, Arg26がPDグリコシラ-ゼactive にimportant residues であることがわかった. Arg3をGlnに変えるとactivity is completely gone.また, three-dimensional にこの near にあるGlu23をGln に変えたoccasion にもPDグリコシラ-ゼactive はdisappear する. Interesting deep いことにGlu23をAspに変changeしてメチレンbasedを一The individual is young and the occasion is active and active.さらに、Arg3をLysに変えたoccasion、Arg26をLysまたはGlnに変えたoccasionにはK mのincreasing large が観看されたことから, これらのRESIDUE が matrix とのcombination にimportant であることがESTIMATE される.チミンダイマ-をA combination of むオリゴデオキシリボヌクレオチドを synthesized, After the phase-complementing lock is formed and the lock is formed, the lock is formed and the allogeneic protein is formedを加えて、CDスペクトルの変化を动べたところ、Glu23をGln The high-order structure of the different body and matrix of the に変えた変に大きな変化を and えることがわかった.この変 variant はチミンダイマ-を contain まない二本 lock 14mer のCD スペクトルには変化をwith The specific binding energy of えないことから, チミンダイマ-DNA に対するhas するものと思われる. The つまりこの変 allogeneic matrix と binding catalytic activity のないprotein であり, the matrix との co-crystallized にAdaptable したものである. The base part of the sub-base is the むデオキシリボヌクレ contained in the シックサイトを一箇オチドをsynthetic し, 変variant の二级目のAPエンドヌクレア-ゼactivated をadjusted べた. A large amount of ほとんどの変different bodyは is cut with a いたときには lockをするがGlu23をGlnに変えたものは全くACTIVE をshowさなかった. Glu23をAspに変えると一级目のanti応は全く开户しないがアベ-シックサイトがあると, わずかにβー break away from をrise こして Lock を cut off することがわかった.この时にTo the right pH がわずかにAcidic side となることを见出した.