逆行遺伝学手法を用いたウィルソン病遺伝子の単離

1.Microdissection/microcloning改良法の確立:この方法によって作成されたDNAライブラリ-は,ヒト核DNAとホモロジ-を示さない多数のクロ-ンを含んでいることが判明した。種々の解析の結果,問題は以下の点にあることを理解した。(1)外来性DNAの試料への混入。(2)PCRによるコンタミDNA以外のartifactual DANの生成。(3)染色体標本DNAの増幅不良。(1)(コンタミDNA)に関しては,反応液容量を減少すること及びpsoralenを用いることによって解決した。(2)に関しては,artifactual DNAは両端に期待される塩基配列を持っていないというシ-クエンシングの結果に基き,新しいプライマ-を作成して2段階のPCRを行うselective PCR amplification法によって克服した。(3)に関しては,増幅不良が染色体DNA固有のものか,標本作成に付随したものか等について今後の解析をまたなければならない。2.スクリ-ニングの効率化(exonーenrichment法の開発):in uitro transcriptを用いて,10^5bpオ-ダ-のゲノムから10^2オ-ダ-のRNAに対応するDNAを選別・増幅することができた。明瞭な選別・増幅を得る為に10^8molecules/dotのRNAが必要であったが,RNA blotはDNA blotに比し約百分の一にハイブリ効率が劣ることが判明。そしてこれはRNA blot→bakingの過程でRNAがこわれていくことによるらしいことがわかった。別のblot法を用いるか新しく改良することによって,10^7 molecules/dotのRNAでも選別・増幅することが可能と思われる。

1.Microdissection/microcloning改良法の確立:この方法によって作成されたDNAライブラリ-は,ヒト核DNAとホモロジ-を示さない多数のクロ-ンを含んでいることが判明した。種々の解析の結果,問題は以下の点にあることを理解した。(1)外来性DNAの試料への混入。(2)PCRによるコンタミDNA以外のartifactual DANの生成。(3)染色体標本DNAの増幅不良。(1)(コンタミDNA)に関しては,反応液容量を減少すること及びpsoralenを用いることによって解決した。(2)に関しては,artifactual DNAは両端に期待される塩基配列を持っていないというシ-クエンシングの結果に基き,新しいプライマ-を作成して2段階のPCRを行うselective PCR amplification法によって克服した。(3)に関しては,増幅不良が染色体DNA固有のものか,標本作成に付随したものか等について今後の解析をまたなければならない。2.スクリ-ニングの効率化(exonーenrichment法の開発):in uitro transcriptを用いて,10^5bpオ-ダ-のゲノムから10^2オ-ダ-のRNAに対応するDNAを選別・増幅することができた。明瞭な選別・増幅を得る為に10^8molecules/dotのRNAが必要であったが,RNA blotはDNA blotに比し約百分の一にハイブリ効率が劣ることが判明。そしてこれはRNA blot→bakingの過程でRNAがこわれていくことによるらしいことがわかった。別のblot法を用いるか新しく改良することによって,10^7 molecules/dotのRNAでも選別・増幅することが可能と思われる。