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非A非B肝炎型ウイルスゲノムのクロ-ニング

非甲非乙型肝炎病毒基因组的克隆

基本信息

批准号：
02808048
负责人：
村上清史
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02808048/
关键词：
非A非B肝炎 HCV クロ-ニングゲノム解析 PCR

项目摘要

血清中のカイロン社のHCV抗体価の高値を与えたHCV肝炎肝癌患者で肝部分切除により試料を得た3例を出発材料としてRNAを抽出精製した。これらの試料でOligoーdT及びランダムプラマ-によるcDNAクロ-ニングを試みたが成功せず,PCR法による部分クロ-ニングを行った。RNAを鋳型とした1次プライマ-によるRーPCRの後、2次プライマ-によるPCRを行なう、RーPCR,double PCR法を行なった。プライマ-はカイロン社の報告に基づく10セット以上のプライマ-を用いたがPositiveな結果は2セットのみであった.PCRで強いバンドを得た配列をプライマ-として、再びcDNAクロ-ニングを試みたが長いcDNAを得ることは成功しなかった。最も強いPCRバンドを与えた試料を用いて既知のHCV配列に基づくプライマ-によるPCRクロ-ニングを繰り返し、HCVサブゲノムのクロ-ニングを行った。同一試料による独立した3個のクロ-ンを単離し、それらの塩基配列を決定する方法でPCRによる変異の影響を排除した。現在3'端の一部を除き全てクロ-ンを得て、その配列を決定した。その結果、1)非構造遺伝子領域の多くの患者試料の塩基配列決定の結果は、カイロン社の報告と約20%以上変異のあるグル-プが日本では高率に検出され、これらのクロ-ン間の変異率は5%以下で近接していた。従って日本ではカイロン社の型(アメリカ型)とは異なるサブグル-プの存在が示唆された(Kaneko et al.,Lancet,1990及びKaneko et al.,in printing,1991)。2)構造遺伝子領域及び5'非遺伝子領域は非構造遺伝子領域に比べ変異率は低く特にEnvの領域でVariable region以外は配列の保存性は高い(Honda et al,in preparation)。今後サブゲノムの接続によって全ゲノムサイズのクロ-ンの作成と各遺伝子部分の癒合遺伝子産物の大腸菌での発現と精製を基にこれらの部分に対する抗体の作成を計画している。

HCV antibody levels in serum were higher than those in liver cancer patients with HCV hepatitis. The Oligo-dT and the cDNA library were successfully tested by PCR. RNA type: 1 time PCR, 2 times PCR, R PCR,double PCR The report of the company is based on the 10 th grade of the company. The Positive result is 2 th grade of the company. The PCR is strong, the company is matched with the cDNA, and the cDNA is tested. The most powerful PCR site and the test sample were used to analyze the HCV gene sequence. Three independent PCR assays for the same sample were performed to determine the PCR sequence. Now a part of the 3'end is divided into two parts: the whole part is divided into two parts: the first part is divided into three parts, and the second part is divided into three parts. The results are as follows: 1) The results of the matrix allocation determination of multiple patient samples in the non-structural genetic sub-field are as follows: the ratio of variation between the two groups is approximately 20% or more, and the ratio of variation between the two groups is approximately 5% or less.従って日本ではカイロン社の型(アメリカ型)とは异なるサブグル-プの存在が示唆された(Kaneko et al., Lancet,1990 and Kaneko et al., in printing,1991)。2)Honda et al,in preparation, has a lower variance rate than non-structural heritage sub-domains except for Variable regions. In the future, the preparation of the whole genome, the development and purification of Escherichia coli from each gene part, and the preparation of antibodies from each gene part will be planned.