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B型肝炎ウイルスX蛋白の転写修飾機能と細胞形質転換能促進

乙型肝炎病毒X蛋白的转录修饰功能及促进细胞转化能力

基本信息

批准号：
17013035
负责人：
村上清史
金额：
$ 3.46万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

HBV X蛋白(HBx)はRNA polymerase subunit 5 (RPB5)及びTFIIBと相互作用し、転写のcoactivatorとして機能することをin vivo及びin vitro転写系で報告した。我々は、多機能制御蛋白HBxについて、集約型アラニン置換変異(Cm)ライブラリー等を用いて,転写修飾の分子機構、HBVウイルス増殖への役割、ヒト初代細胞への形質転換能の検討を行い、以下の結果を得た。1)HBxのCm変異ライブラリーの解析により、RPB5結合に必須な配列をcoactivationドメイン内に限定した。この配列は、coactivationに必要な配列の一部の配列であった。HBxの核内標的であるRPB5のCm及び点置換変異(Pm)ライブラリーを用いて、HBxの結合に必須な6残基を特定し、その内4残基はTFIIFサブユニットRAP30との結合にも必須であった。これら4残基の変異酵母RPB5は、増殖温度感受性を示した(J. Biochem(Tokyo),2005)。2)RPB5のDNA結合能を、ゲルシフト法で確認した。結合に必須な残基をRPB5のCm及び点置換変異(Pm)ライブラリーを用いて解析した結果、溶媒に表出したT111が必須で、S113が重要な役割を果たしている結果を得て、RPB5のDNA結合能がRPB5の転写修飾の標的である可能性が提出された(投稿中)。3)ヒト初代細胞の不死化と、ヒト不死化細胞の形質転換にHBxがどのような効果を持つかを解析した。野生型及び各種HBx発現レトルウイルスをヒト初代細胞及びヒト不死化細胞に導入し、不死化率と形質転換率を測定した。その結果、HBxは単独では、ヒト初代細胞の不死化にも、hTERT導入ヒト不死化細胞の形質転換にも影響を与えなかった。しかし、hTERT導入ヒト不死化細胞に活性化型RASの導入による老化誘導(Oncogene-induced senescence : OIS)は、HBxの導入によって克服された。RAS+HBx発現ヒト不死化細胞は、soft agarでコロニー形成能とヌードマウスで造腫瘍性を示した。HBxのOIS克服にはN端ドメインとcoactivationドメインが共に必要であり、coactivationドメイン単独では、不死化の克服は観察されたが、anchorage-independentな増殖と形質転換は観察されなかった(投稿中)。現在HBx Cmライブラリーを用いてOISに必要な配列の特定を行っている。

HBV X protein (HBx) interacts with RNA polymerase subunit 5 (RPB5) and TFIIB, and functions as a coactivator in vivo and in vitro. In this study, we investigated the molecular mechanism of modification, HBV replication, and morphological transformation of primary cells by using multifunctional regulatory protein HBx, intensive regulatory protein substitution (Cm), and the following results were obtained. 1)HBx and Cm are different from each other in the analysis, RPB5 binding must be matched with the activation within the limit. This is a part of the arrangement, coactivation. HBx's nuclear internal standard, RPB5's Cm and T point substitutions (Pm), HBx's binding requirements, 6 residues, and 4 residues, TFIIF's binding requirements, RAP's 30 residues. The sensitivity of RPB5 to growth temperature was demonstrated for four residues (J. Biochem(Tokyo), 2005). 2) DNA binding ability of RPB5 was confirmed by DNA binding assay. The results of the analysis of the binding required residues in RPB5, the expression of T111 in the solvent, the results of S113 as an important binding residue, and the possibility of the DNA binding energy of RPB5 as the target of RPB5 modification are proposed (in submission). 3) Analysis of the morphological and qualitative changes of the primary cells Wild type and all kinds of HBx development and transformation rate of primary cells and immortal cells were determined. As a result, HBx can only be used for immortalization of primary cells, and hTERT can be used for immortalization of primary cells. The introduction of hTERT and HBx into non-mortalized cells resulted in the induction of Oncogene-induced senescence (OIS). RAS+HBx is a new type of soft agar that can be used to form cells that are resistant to tumor growth. HBx's OIS overcomes the need for N-terminal coactivation, coactivation, and non-death. Now HBx Cm is used for OIS to configure the required rows.