糸状菌分泌酵素遺伝子を利用した酵母分泌系の解析

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糸状菌Rhizopus niveusの菌体外アスパルティックプロテイナ-ゼI(RNAPーI)遺伝子をSaccharomyces cerevisiaeに導入すると効率よく菌体外に分泌されるが、このプロ配列中に変異を導入した改変遺伝子をS.cerevisiaeに導入したところ全く分泌されなくなった。そこで本研究ではこのような改変RNAPーI遺伝子を導入したS.cerevisiaeに対し各種の変異原で変異をかけ、改変RNAPーI遺伝子産物を菌体外に分泌するようになる変異株を取得し解析することを目的とした。変異株はカゼインを含む培地上でハロ-を形成するようになるものを選択した。まず変異原としてUVを用い約3800株のコロニ-に対してカゼイン培地上でのハロ-形成を検討したところこのうち121株がハロ-形成を行なった。これらの変異株のうちその変異が染色体上に由来するものを選択するために、形成されたハロ-が比較的大きい70株についてRNAPーI遺伝子を含むプラスミドのキュアリングを行なった。その結果、プラスミドのキュアリングによりハロ-形成をしなくなった株が37株存在した。そこでこれら変異株に再度改変RNAPーI遺伝子を導入し、カゼイン培地上でハロ-形成能を獲得した株については変異が染色体上に由来する可能性が強いと考えさらに解析を進めた。このような株は9株存在し菌体外へのRNAPーIの分泌量について培養上清の酵素活性測定、SDSーPAGEなどにより解析を行なった結果、分泌量が比較的多くSDSーPAGE上で成熟型RNAPーIと同じ位置にバンドが見られる変異株が1株得られている。変異原としてEMSを用いたものについても約4000株についてハロ-形成を検討したところ138株の変異株が得られた。このうち16株についてプラスミドのキュアリングと再形質転換を行ない、染色体上に変異が導入されていると思われるもの1株を得ている。現在、新たな変異株の取得を続行すると共にこれまでに得られた変異株の解析をさらに進めている。