新しい特異的なコリンアセチルトランスフェラ-ゼ活性測定法の開発とその応用

アセチルコリン(ACh)の合成酵素であるコリンアセチルトランスフェラ-ゼ(ChAT)の活性は、現在のところ主としてFonnum法(1975)により測定されている。すなわち、放射標識した〔 ^<14>C〕acetyl CoAとコリンを用いて〔 ^<14>C〕AChを合成させ、Kalignostを含む有機溶媒中に抽出して放射活性を測定する方法である。抽出段階で、種々の放射標識物質が混入する可能性が考えられ、Fonnum法には問題があると考えられる。この研究課題では当研究室で独自に作製した抗ACh抗体を用いて、新しい特異的なChAT活性の測定法の開発を試みた。まず家兎で作製した抗ACh抗血清より、抗ACh抗体を硫安分画法により調製した。家兎の血液より採取したバッフィ-コ-ト分画をホモジェネ-トし、〔 ^3H〕acetyl CoAおよびコリンと37℃で一定時間インキュベ-ションした。氷水中につけて反応を停止させ、抗ACh抗体を加えて生成した〔 ^3H〕AChを抗体に結合させた。抗体と結合した放射活性を液体シンチレ-ション法で測定した。同じサンプルをFonnum法を用いてACh合成活性を測定した。抗体に結合した〔 ^3H〕AChはサンプルのインキュベ-ション時間に比例して増大した。Fonnum法で得られた測定結果、この抗ACh抗体を用いて得られた結果とほぼ相関した。ラット脳サンプルにおいても同じ様な結果が得られた。抗ACh抗体はAChに対する特異性が高いので、この抗体と結合した放射活性はACh生成量を反映するものである。したがって家兎バッフィ-コ-トにACh生合成活性が存在することが確認された。抗ACh抗体を用いる方法は、ACh生合成活性の存在が未確認のサンプルにおいて有用な方法である。

アセチルコリン(ACh)の合成酵素であるコリンアセチルトランスフェラ-ゼ(ChAT)の活性は、現在のところ主としてFonnum法(1975)により測定されている。すなわち、放射標識した〔 ^<14>C〕acetyl CoAとコリンを用いて〔 ^<14>C〕AChを合成させ、Kalignostを含む有機溶媒中に抽出して放射活性を測定する方法である。抽出段階で、種々の放射標識物質が混入する可能性が考えられ、Fonnum法には問題があると考えられる。この研究課題では当研究室で独自に作製した抗ACh抗体を用いて、新しい特異的なChAT活性の測定法の開発を試みた。まず家兎で作製した抗ACh抗血清より、抗ACh抗体を硫安分画法により調製した。家兎の血液より採取したバッフィ-コ-ト分画をホモジェネ-トし、〔 ^3H〕acetyl CoAおよびコリンと37℃で一定時間インキュベ-ションした。氷水中につけて反応を停止させ、抗ACh抗体を加えて生成した〔 ^3H〕AChを抗体に結合させた。抗体と結合した放射活性を液体シンチレ-ション法で測定した。同じサンプルをFonnum法を用いてACh合成活性を測定した。抗体に結合した〔 ^3H〕AChはサンプルのインキュベ-ション時間に比例して増大した。Fonnum法で得られた測定結果、この抗ACh抗体を用いて得られた結果とほぼ相関した。ラット脳サンプルにおいても同じ様な結果が得られた。抗ACh抗体はAChに対する特異性が高いので、この抗体と結合した放射活性はACh生成量を反映するものである。したがって家兎バッフィ-コ-トにACh生合成活性が存在することが確認された。抗ACh抗体を用いる方法は、ACh生合成活性の存在が未確認のサンプルにおいて有用な方法である。