ミスマッチ変異検出を利用した未知変異遺伝子スキャンニング法の開発

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1.カルボジイミドグループを有するビオチン誘導体の合成…カルボジイミド化合物はチミン(T)はグアニン(G)に結合することが知られており、これにビオチン誘導体を結合させることによりミスマッチDNAを発色により検出可能にした。そのために先ずカルボジイミドビオチン化合物(Carb〜Bi)を合成した。ついでカルボジイミドがT,Gに特異的に結合することを示すためにアデニン(A),シトシン(C)の一本鎖ホモポリマー、TあるいはGを一つ含む一本鎖オリゴマーを作成し、Carb〜Biを反応させたところ、TやGとは反応したが、AやCとは反応しないことがわかった。さらに二本鎖DNAについて検討した。制限酵素Hin fIによる切断により、つき出た末端Tをもつものを作成した。一方、Hae III切断により平滑末端をもつ化合物を準備した。その結果、末端がつき出た基質はCarb〜Biと反応し、平滑末端は反応しないことがわかった。ついで、一つのミスマッチを有する二本鎖DNAを用意した。そのために、一塩基のみがG-T或いはA-Cミスマッチを示す相補的な一本鎖DNAを各々M13ファージにクローン化した。各々のDNAのヘテロデュプレックスを形成させ、一つのミスマッチ部位を含む2本鎖DNA部位を切り出し、Carb〜Bi化合物を用いた発色反応を試みたところ、ミスマッチDNAとのみ強く反応し、完全な相補対DNAとは反応しないことがわかった。2.一本鎖のDNAをCarb〜Biで標識し、サザン法のプローブとして利用する方法……カルボジイミドは一本鎖のTやGに結合する性質があるので、一本鎖プローブを標識し、先ず検出感度の検定を行なった。その結果、1pgでも発色により検出可能なことがわかった。そこで、次に標識プローブとして用いるべくハイブリダイゼーションによる感度検定を行なったところ、2pgでも検出できることが明らかとなった。このようにCarb〜Biはミスマッチの検出とプローブの標識に利用できることが明らかとなった。