p57KIP2遺伝子の小児腫瘍への関与の検討

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p57KIP2の腫瘍サプレッサーとしての活性の有無を明らかにするために、発現ベクターにp57KIP2遺伝子を組み込んだ組換え体を作成しG401細胞に感染させてコロニー形成能を観察したところ、ベクターのみのコントロールと比べてコロニー数が著明に減少していることがわかった。この結果は野生型のp57KIP2遺伝子は腫瘍抑制活性がある可能性を示した。そこでその結果を確認するために、テトラサイクリン添加で誘導可能な発現ベクターに組み込んだp57KIP2を作成し、コロニー形成能を観察することにした。現在これらの細胞株がKIP2蛋白質を発現しているかどうかをWestern Blotで確認している。転写抑制のメカニズムを調べるために、先ずRDやG401等の腫瘍細胞株のゲノムDNAを用いてp57KIP2遺伝子を含む周辺領域2kbの範囲内でメチレーションの状況を調べた。そのために正常およびがん組織のメチル化感受性の制限酵素を用いてサザーン解析を行った。先ず、正常組織の脳、骨格筋などを用いた。解析する領域の全塩基配列はわかっていたので、使用する制限酵素としてメチル化感受性酵素を用いた。結果、メチル化感受性制限酵素の切断部位はすべて切断された。ついで、ガンで解析を行った。ウィルムス腫瘍由来のG401細胞株やRhabdomyosarcoma由来のRD細胞株を使用した。また、発現していない正常組織として肝臓を同時に解析した。用いた制限酵素は、メチル化感受性酵素である。結果は、予期に反して正常肝臓を含め、二つの細胞株とも解析可能なDNA断片はすべて生じ、両アリルともメチル化を受けていないことが判明した。